[发明专利]一种基因编辑转基因作物编辑位点特异性PCR方法及其应用

说明书

本发明公开一种基因编辑转基因作物编辑位点特异性PCR方法及其应用，具体公开了检测方法包括如下步骤。1)收集序列：收集靶标基因野生型核苷酸序列和基因编辑作物中基因编辑核苷酸序列；(2)设计引物/探针：根据上述核苷酸序列，在编辑序列的两侧设计野生型基因和编辑基因的通用引物对；(3)PCR扩增：以基因编辑作物的基因组DNA为模板，利用引物探针组合进行PCR扩增检测。本发明利用通用引物和编辑位点特异性TaqMan探针，能特异性识别并准确定量基因编辑作物，适用于基因编辑作物的身份鉴定和定量检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中DNA检测方法，尤其涉及一种针对基因编辑转基因作物的编辑位点特异性TaqMan探针PCR方法，用于基因编辑转基因作物的编辑位点特异性定性定量检测。

背景技术

基因编辑技术作为近年来兴起的一种新的育种技术，能够对植物基因组进行高效、精准、特异的修饰，在植物领域广泛应用。如杜邦先锋·公司利用基因编辑技术敲除Wx1基因培育的糯玉米、陶氏益农公司运用ZFN技术培育成的一种基因组编辑玉米、抗除草剂转基因油菜、抗褐变蘑菇、利用CRISPR/Cas9技术编辑ARGOS8启动子区获得的抗旱高产的基因编辑玉米等。

基因组编辑技术可以对基因组进行插入、突变等修饰操作，从而获得不同类型的基因组编辑转基因产品。目前在国际上基因组编辑技术对基因组进行修饰的种类主要分为3类：(1)SDN1类型，不涉及修复模板，不引入任何外源基因，只包括点突变、少量几个碱基插入或缺失；(2)SDN2类型，通过同源重组途径进行修复，导致基因1个到几个碱基突变(20bp)；(3)SDN3类型,含有长度达到数kb的外源DNA。由于SDN3类转基因作物含有较长的外源DNA片段，可以采用传统的转化体特异性PCR方法对该类基因编辑转基因作物进行特异性识别和定量检测。而SDN1和SDN2类基因编辑作物由于直接在生物自身基因组上进行定向编辑，最终基因编辑产品一般在靶标位点仅含有少数碱基的突变，与传统采用的自然突变和人工诱变突变体具有高度的相似性。对于不含有外源DNA片段的SDN1和SDN2型基因编辑转基因作物不适宜用传统的转化体特异性检测方法进行身份鉴定和定量检测。

我国《农业转基因生物安全评价管理办法》中规定，农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品。虽然目前在国外批准商业化种植和销售的基因编辑转基因产品与以前传统转基因生物相比，其研究者往往声称并不含有任何外来基因序列或蛋白序列，但其仍然符合“利用基因工程技术改变基因组构成”特征，属于农业转基因生物。依据法规，我国安全管理部门要对研发中和商业化的基因编辑转基因产品进行安全监管和检测。针对基因编辑转基因产品的检测，前期已经提出了很多方法，如限制性片段长度多态性分析(PCR/RE)、CAPS(derivedcleaved amplified polymorphic sequence)衍生方法、限制性酶切PCR法、错配切割法、临界退火温度PCR(ACT-PCR)、高分辨率溶解曲线、Sanger测序法、扩增片段长度多态性、PCR单链构象多态分析法等。除了测序法，以上这些方法都只能定性检测转基因产品中的靶标基因是否被编辑，不能识别特异的编辑位点，不能满足转基因生物安全监管中对转基因产品进行精准身份识别和准确定量检测的需求；测序法虽然能通过序列分析可识别特异的编辑位点，但该方法相对耗时费力，且不能满足转基因生物安全监管中对转基因产品进行准确定量检测的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有基因编辑作物检测方法存在的不足，提供一种基因编辑转基因作物的编辑位点特异性定性定量PCR方法。本发明通过对基因编辑转基因产品的分子特征进行分析，提供一种能对转基因产品进行精准身份识别和准确定量检测的编辑位点特异性定性定量检测方法，为基因编辑转基因产品的安全监管和产权保护提供技术支撑。

本发明的目的是这样实现的：