[发明专利]一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种生产原儿茶酸的大肠杆菌构建方法及应用，该方法包括：PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因；构建质粒pET‑PmLAAD‑HmaS、质粒pCDF‑HMO‑BFD、质粒pACYC‑HpaBC和质粒pACYC‑PobA和质粒pRSF‑HFD1；将上述部分质粒共同转入大肠杆菌MG1655RARE感受态细胞中，分别得到第一重组大肠杆菌工程菌和第二重组大肠杆菌工程菌。根据本发明实施例，该方法获得的重组大肠杆菌可使原儿茶酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用。

背景技术

原儿茶酸也称为3,4-二羟基苯甲酸，存在于木犀科植物紫丁香、蓼科植物头花蓼、冬青科植物冬青等植物的叶中，是具有独特生理活性及药理特性的次级代谢产物。针对不同的分子靶点，原儿茶酸具有多种多样的生物活性：可预防一些慢性变性、心血管和神经退行性疾病；可作为一种新型合成多聚物和塑料的组成部分；具有良好的电化学活性的与多糖物质结合的复合物；可合成生物塑料；在药理特性上具有抗菌、抗炎、抗氧化、防衰老等作用，还可潜在地用于药物和功能食品中。基于原儿茶酸的优异特性，其在医药、饲料、环保等领域的需求量不断增长，具有十分明显的生产意义。而植物提取的方法价格昂贵且产率低；化学合成法是市场目前普遍采用的方法，但其产生过多三废，不符合我国环保国情；采取的生物合成法使用廉价原料和易操作底盘细胞，具有成本低、能耗低，绿色环保等优势。

生物合成原儿茶酸的研究有Okai等利用过生产苯丙氨酸的谷氨酸棒状杆菌ATCC21420菌株，通过模拟大肠杆菌莽草酸途径，过表达大肠杆菌CPL基因(Ubic)，终以分批补料方式喂养117.0g/L葡萄糖，培养72小时后产出1.14g/L原儿茶酸。Kallscheuer等以谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)为底盘细胞，敲除nagIKL-nagR-nagT-genH(cg3349-c54)基因簇，以防止目的化合物对羟基苯甲酸和原儿茶酸的降解，再通过表达天然编码转酮醇酶基因(tkt)，以葡萄糖为底物，优化后生产2.0g/L原儿茶酸。Luo等利用电脑设计大肠杆菌莽草酸代谢途径，将大肠杆菌遗传中心株系4474敲除莽草酸脱氢酶(aroG)阻断下游合成途径，再通过自身启动子与强启动子交换，产生4.74g/L原儿茶酸。Weber等描述了在工程酵母中通过异种生物合成途径，将芳香氨基酸生物合成途径的中间体3-脱氢莽草酸合成原儿茶酸和邻苯二酚，再转化为顺,顺-己二酸。Curran等利用BY4741酵母菌株，敲除aro3，aro4基因，进行强启动子替换，过表达经密码子优化的莽草酸脱水酶和邻苯二酚-1,2-加双氧酶，经40g/L的葡萄糖发酵培养后，产生约0.3g/L的原儿茶酸。原儿茶酸从头合成通常伴随着对宿主细胞的毒性，这可能会导致非完全的生长和产量。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法。该方法可使原儿茶酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。

为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因，将PmLAAD和HmaS基因双片段、HMO和BFD基因双片段用BsaI酶切，随后分别连接进入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pETDuet-1、pCDFDuet-1，得到质粒pET-PmLAAD-HmaS和质粒pCDF-HMO-BFD；将HFD1酶切后，连接进入表达载体pRSFDuet-1中得到质粒pRSF-HFD1；将HpaBC、PobA基因单片段酶切，分别连接经BamHI和XhoI双酶切的pACYCDuet-1载体，获得质粒pACYC-HpaBC和质粒pACYC-PobA；