[发明专利]一种耐冬山茶叶片总RNA提取方法

说明书

本发明的目的在于提供一种耐冬山茶叶片总RNA提取方法，从耐冬山茶植株上剪取革质化后的嫩叶，在盛有液氮的研钵中加入等体积交联聚乙烯基吡咯烷酮和样本粉末研磨，抽取裂解液上清加入等体积的TRIZOL试剂，加入五分之一体积氯仿，混匀乳化呈乳白色，静置，离心；抽取上清液至新的RNase‑free tube中，加入等体积的乙醇，迅速混匀；将混合液加入RNA吸附柱，离心，倒掉收集管中的废液；加入乙醇，离心，倒掉废液；将RNA吸附柱置于一个离心管中，加入RNAfree‑H₂O，室温静置，离心。本发明的有益效果是提取的总RNA可用于pacbio平台进行全长转录组测序或全转录组测序分析。同时，该技术成本较试剂盒低廉。

技术领域

本发明属于RNA基因提取技术领域，涉及一种耐冬山茶叶片总RNA提取方法。

背景技术

目前植物总RNA提取一般采取试剂盒方法。试剂盒成本较高，且存在浓度低、完整性差等问题，例如takara和天根多糖多酚型试剂盒提取的RNA浓度较低、完整性较差、bioflux试剂盒提取的RNA降解严重等。常规TRIZOL法无法提取多糖类组织，CTAB无法提取多酚类组织、SDS等传统手提方法均不能有效获得高质量耐冬山茶叶片RNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐冬山茶叶片总RNA提取方法，本发明的有益效果是提取的总RNA可用于pacbio平台进行全长转录组测序或全转录组测序分析。同时，该技术成本较试剂盒低廉。

本发明所采用的技术方案按照以下步骤进行：

1、从耐冬山茶植株上剪取革质化后的嫩叶，用锡纸包裹放入液氮中速冻，备用。在研钵中加入等体积交联聚乙烯基吡咯烷酮，边加液氮边快速研磨，尽快使耐冬山茶叶片成粉末状；

2、取叶片粉末加入裂解液试剂，震荡机上混匀至无明显大颗粒物状态，静置裂解，低温离心；

3、裂解液上清加入等体积的TRIZOL试剂，室温静置；

4、加入五分之一体积氯仿，混匀乳化呈乳白色，静置，离心；

5、抽取上清液至新的RNase-free tube中，加入等体积的乙醇，迅速混匀；将混合液加入RNA吸附柱，离心，倒掉收集管中的废液；

6、加入乙醇，离心，倒掉废液；

7、将RNA吸附柱置于一个离心管中，加入RNAfree-H2O，室温静置，离心。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

1、10s内从耐冬山茶植株上剪取革质化后的嫩叶，用锡纸包裹放入液氮中速冻1h以上，备用。在研钵中加入等体积交联聚乙烯基吡咯烷酮(pvpp)，边加液氮边快速研磨，尽快使耐冬山茶叶片成粉末状；

2、取50-100mg叶片粉末加入裂解液Fruit-mate^TM for RNA purification(takara)试剂，震荡机上混匀至无明显大颗粒物状态，4℃静置裂解5min，12000xg 4℃低温离心5-10min(视裂解程度适当延长)；

3、裂解液上清加入等体积的TRIZOL试剂，室温静置5-10min(视裂解程度可适当延长)；

4、加入五分之一体积(200ul)氯仿，混匀乳化呈乳白色，静置5min，12000xg 4℃离心15min；

5、抽取上清液(切勿吸到中间层DNA及下层蛋白质)至新的1.5ml的RNase-freetube中，加入等体积的75％乙醇，迅速混匀；将混合液加入RNA吸附柱(市面售卖的均可)，12000xg离心30s，倒掉收集管中的废液(混合液较多时，可分两次加入)；