[发明专利]一种特异识别副溶血性弧菌TDH的核酸适配体TDHA的序列和应用

说明书

本发明涉及一种特异识别副溶血性弧菌TDH的核酸适配体TDHA的序列及其应用，该核酸适配体TDHA的序列为：5'‑GAGCGGCACGAACCAGTAAAGTCTTCCCGACCGC‑3'；本发明的核酸适配体TDHA能高亲和力、高特异性地识别副溶血性弧菌TDH；以核酸适配体TDHA作为副溶血性弧菌TDH的识别元件，建立副溶血性弧菌TDH的检测方法和制备检测试剂，可用于环境中副溶血性弧菌污染的监测，临床中副溶血弧菌感染的诊断、病情评估，以及基础研究中副溶血性弧菌TDH的生物学功能分析等应用领域，具有方法简便、快速、特性好等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异识别TDH的核酸适配体TDHA的序列及其在检测副溶血性弧菌TDH方面的应用。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus），为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽孢。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。副溶血性弧菌引起的食物中毒经烹饪不当的海产品或盐腌制品传播。常见的为海蜇、海鱼、海虾及各种贝类。因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可发生食物中毒。该病常年均可发生，潜伏期5-72小时，平均24小时，临床表现可从自限性腹泻至中度霍乱样病症，有腹泻、腹痛、呕吐和低热等症状。粪便多为水样，少数为血水样，恢复较快，病后免疫力不强，可重复感染。

溶血素是副溶血性弧菌致病的最主要原因，包括耐热直接溶血素（ThermostableDirect Hemolysin，TDH）、耐热直接溶血素相关溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）和不耐热溶血素（Thermolabile Hemolysin，TLH）。流行病学调查研究表明TDH是副溶血性弧菌最主要致病因子，临床上分离出的副溶血性弧菌几乎95%以上都会在特殊的血平板上产生溶血环，被称作神奈川现象（Kangawa Phenomenon，KP）。目前，国内外针对副溶血性弧菌TDH的检测研究大多数采用的是分子生物学技术，其中以多重PCR、荧光实时定量PCR等的运用较多。虽然直接检测副溶血性弧菌TDH更加方便、快捷，但由于抗体特异性问题，只有极少数的免疫学技术应用于这方面。

核酸适配体（Aptamer）是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。 通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX），从核酸分子随机文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体与靶标的结合具有高亲和力、高特异性等特点。作为核酸类分子，核酸适配体可直接合成并进行各种化学修饰，具有成本低、制备快等优点。将核酸适配体作为靶标的识别元件，已应用于各种靶标的快速、准确检测。已有研究将核酸适配体作为副溶血性弧菌的识别元件，建立了可检测副溶血性弧菌菌体的传感器检测方法（J Agric Food Chem。2019，67：2313-2320）。如能利用核酸适配体的优势，建立快速、准确的副溶血性弧菌TDH检测方法，将具有广阔的应用和基础研究价值。

本发明提出一种特异识别副溶血性弧菌TDH的核酸适配体TDHA。TDHA是以大肠杆菌表达的副溶血性弧菌TDH为靶标，通过SELEX技术从体外人工筛选并经序列优化后获得。TDHA能够特异识别TDH，而不结合其他副溶血性弧菌的溶血素。目前尚未见以特异性核酸适配体为识别元件，建立副溶血性弧菌TDH检测试剂盒的报道。发明内容

本发明目的在于提出一种特异识别副溶血性弧菌TDH的核酸适配体TDHA的序列及其应用，包括将TDHA作为TDH的识别元件，建立副溶血性弧菌TDH检测试剂盒，用于副溶血性弧菌TDH污染的监测，以及副溶血性弧菌感染病情的诊断、预测和监控等。

本发明通过以下技术方案实现：

首先由上海生工公司合成核酸适配体TDHA序列，并在TDHA的5’端或3’端进行修饰、标记（如生物素或者荧光基团），然后进行应用研究：以TDHA为识别元件，分别建立可用于检测副溶血性弧菌TDH的比色法生物传感器、凝胶迁移阻滞实验、酶联适配体吸附法。