[发明专利]一种基于3D打印功能体的微孢子虫DNA的提取方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于3D打印功能体的微孢子虫DNA的提取方法、试剂盒及其应用，属于核酸提取方法及应用技术领域。本发明用裂解液对样本进行裂解处理，通过手持或机器持3D打印特形功能体在裂解液、清洗液、洗脱液中快速转移来实现DNA提取，无需移液、离心等耗时繁琐步骤，人工劳动密度低、成本低、通量高、DNA品质高、对设备和操作空间需求小，具有自动化和高通量下游应用前景。本发明还提供了该核酸提取方法的应用试剂盒及其在动植物宿主中微孢子虫病原PCR快速诊断中应用，本发明解决了现行微孢子虫体外PCR诊断技术靶标核酸制备复杂、耗时、通量低等问题，可以广泛应用于各种微孢子虫的快速检测中，显著提高检测通量、操作便利性、检测灵敏度与准确度。

技术领域

本发明属于核酸提取方法及应用技术领域，具体涉及一种基于3D打印功能体的微孢子虫DNA的提取方法、试剂盒及其应用。

背景技术

微孢子虫，是一种多样化的门，几乎能寄生所有类型的动物，其中昆虫和鱼类是其最主要的寄主。有报道指出，致病性微孢子虫通过食物链对人类健康存在潜在风险，它们在经济昆虫(蚕和蜜蜂)间、鱼类之间的传播，不仅会引起病害的爆发而带来生产上的减产，同时也影响下游产品(蚕蛹、蜂蜜、鱼肉)作为食物来源的食品安全性。

通过微孢子虫诊断技术，及时发现微孢子虫并切断其传播，对于经济昆虫饲养和渔业均具有重要防控、增产意义。目前的微孢子虫诊断技术主要有：显微镜检查技术(镜检，Microscopy)，免疫学手段和分子检测技术(PCR诊断技术)。镜检简单实用，但对操作人员而言工作量大、经验要求高，检测灵敏度因人而异，漏检风险高；免疫学手段稳定性差、灵敏度不高、操作繁琐、实用性较差；镜检和免疫学手段的低灵敏度带来高漏检风险，漏检的微孢子虫引起持续传播，带来生产减产和食品安全。

核酸PCR诊断是一种重要的病原检测方法，相比镜检和免疫学手段，核酸PCR诊断具有高修改灵活性、高检测灵敏度以及可以更快、更早地获得检测结果等优势，在农业病害控制、畜牧业疫病检验和食品安全领域发挥着重要作用。然而，PCR诊断技术包含多个环节：模板核酸提取，PCR扩增，结果读出；而模板核酸提取过程存在着诸多问题，如操作繁琐复杂、通量低、交叉污染风险高、提取过程干扰因素多等，大大制约了柞蚕病原分子检测技术的检测通量、灵敏度、时效性，成为PCR诊断方法生产应用的关键瓶颈。

从复杂的生物体样本中提取核酸，尤其从动物组织样本中提取核酸，传统液相提取手段因污染重、样本需求量大而逐渐被淘汰。固相分离大多集中于磁力分离，虽然磁力分离被认为具有下游高通量和自动化应用的前景。Li P.等人也报道了高效、高通量的磁力分离在微孢子虫PCR诊断中的应用前景。但方法过于单一，非磁力分离的固相核酸分离，如传统柱式提取等，将结合核酸的固相载体从裂解液体系中分离，仍然需要依赖多步离心或反复移液等繁琐操作，存在劳动密集、通量低的局限性，是目前核酸固相提取技术亟待解决的关键问题。

为解决上述问题，开发一种过程简单、高通量、快捷的核酸提取技术具有重要意义。

发明内容

本发明针对现行微孢子虫核酸提取过程繁琐复杂、通量低等问题，本发明首先提供了一种基于3D打印特形功能体的微孢子虫DNA提取方法，包括如下步骤：

(1)用裂解液对待测微孢子虫样本或微孢子虫宿主样本进行裂解处理；

(2)通过手持或机器持将3D打印特形功能体的核酸结合区伸入步骤(1)所得溶液中，进行DNA的结合；

(3)通过手持或机器持将完成步骤(2)的3D打印特形功能体的核酸结合区转移至清洗液中，进行清洗；

(4)将完成步骤(3)的3D打印特形功能体取出、干燥；

(5)通过手持或者机器持将完成步骤(4)的3D打印特形功能体的核酸结合区置入洗脱液中，进行洗脱，所得洗脱液即为微孢子虫DNA溶液。