[发明专利]通过CTRP6介导的动脉粥样化动物模型及其建立方法

权利要求书

1.一种通过CTRP6介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

步骤1、构建腺病毒表达载体Ad-CTRP6；

腺病毒表达载体具体构建步骤如下：

步骤1.1、采用HindⅢ、SalⅠ双酶切小鼠CTRP6 cDNA质粒，电洗脱回收CTRP6 cDNA片段，HindⅢ、SalⅠ双酶切pCMV-CTRP6质粒，电洗脱法回收pAdTrack-CMV HindⅢ和SalⅠ双酶切线性片段，再通过T4DNA连接酶连接CTRP6 cDNA 片段与pAdTrack-CMV HindⅢ、SalI双酶切线性片段，将连接得到的产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，经Kan+LB培养基培养后采用碱裂解法提取重组质粒；

步骤1.2、将步骤1.1所得的pAdTrack-CTRP6重组质粒经PemⅠ酶切，电洗脱回收线性片段，将酶切后的pAdTrack-CTRP6 PemⅠ酶切线性片段电转法转入含pAdEasy-1的E.coliBJ5183电感受态细胞，转化产物经Kan+LB固体培养基培养后采用碱性裂解法提取pAdEasy-CTRP6重组质粒；

步骤1.3、采用PacⅠ酶切步骤1.2所得的pAdEasy-CTRP6得到Pac I线性化重组质粒pAdEasy-CTRP6片段，采用5μg的 Pac Ⅰ线性化重组质粒p AdEasy-CTRP6片段转染HEK293细胞，转染后培养细胞7～10天，每天观察细胞生长及绿色荧光蛋白表达，当细胞中绿色荧光蛋白表达呈“彗星”状并出现细胞病变效应时，收集HEK293细胞并涡旋震荡4次使细胞裂解，裂解后在12000r/min的条件下离心3 min，收集上清液即为Ad-CTRP6病毒液，将Ad-CTRP6病毒液于-80℃保存备用；

步骤1.4、感染当天，将200μL所述步骤1.3得到的Ad-CTRP6病毒液加至1.5 mL DEME完全培养液中培养90min后，加入3.5 mLDMEM完全培养液培养，感染第3天，细胞出现明显细胞病变效应并伴有脱落时，收集病毒，再重复感染Ad-CTRP6病毒液4次，将所得的病毒总和进行收集即为腺病毒表达载体Ad-CTRP6；

步骤2、将步骤1得到的所述腺病毒载体Ad-CTRP6通过尾部静脉注射到ApoE^-/-小鼠中，注射后采用高脂饲料喂养6周，第四周时再注射一次腺病毒表达载体Ad-CTRP6，6周后得到的小鼠即得到动物模型。

2.根据权利要求1所述的一种通过CTRP6介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1.3中转染前1天将HEK293细胞于直径为60mm的培养皿培养，转染时细胞的细胞密度30%-50%。

3.根据权利要求1所述的一种通过CTRP6介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1.4中感染前1天，将HEK293细胞于直径为100mm的培养皿，感染时细胞密度75%-85%。

4.根据权利要求1所述的一种通过CTRP6介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤2中高脂饲料的胆固醇和脂肪量为1.5% cholesterol + 15% fat。

5.根据权利要求1所述的一种通过CTRP6介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤2中注射入ApoE^-/-小鼠的腺病毒表达载体Ad-CTRP6的浓度是1×10¹¹vp/mL。