[发明专利]一种固相时间分辨荧光免疫标记物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述固相时间分辨荧光免疫标记物包括蛋白质标记的β-二酮体类螯合剂、稀土金属离子和生物特异性结合反应物。

2.如权利要求1所述的固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述蛋白质标记的β-二酮体类螯合剂与稀土金属离子通过螯合作用结合，所述和β-二酮体类螯合剂标记的蛋白质与生物特异性结合反应物通过交联作用结合。

3.如权利要求1或2所述的固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述蛋白质包括酪蛋白、小牛血清蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或苹果脱酸氢酶；

优选地，所述β-二酮体类螯合剂包括BCOT、BCDOT、BHHCT、BTBCT或BCTOT；

优选地，所述稀土金属离子为三价稀土金属离子；

优选地，所述生物特异性结合反应物包括抗体、抗原、半抗原或链霉亲和素。

4.如权利要求1-3中任一项所述的固相时间分辨荧光免疫标记物，其特征在于，所述蛋白质与β-二酮体类螯合剂的摩尔比为1:10-1:300，优选1:30-1:150；

优选地，所述β-二酮体类螯合剂上的标记蛋白质与生物特异性结合反应物的摩尔比为1:10-10:1；

优选地，所述β-二酮体类螯合剂与稀土金属离子的摩尔比为1:10-10:1。

5.如权利要求1-4中任一项所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将蛋白质与β-二酮体类螯合剂混合反应，得到结合物A；

(2)使用交联剂a活化结合物A，得到待结合物A；使用交联剂b活化生物特异性结合反应物，得到待结合物B；

(3)将待结合物A和待结合物B进行交联反应，得到交联物C；

(4)将交联物C与稀土金属盐混合，得到所述固相时间分辨荧光免疫标记物。

6.如权利要求5所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白质与β-二酮体类螯合剂的摩尔比为1:10-1:300，优选1:30-1:150；

优选地，步骤(1)所述混合前将蛋白质溶解于缓冲液中，浓度为0.02-1％；

优选地，所述缓冲液包括碳酸缓冲液，浓度为0.01-0.5M，pH值为9-11；

优选地，步骤(1)所述混合前将β-二酮体类螯合剂溶解于有机溶剂中，浓度为0.02-1％；

优选地，所述溶剂包括无水乙醇、无水甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或苯乙烯中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，步骤(1)所述反应的温度为4-50℃，时间为0.5-2h。

7.如权利要求5或6所述的固相时间分辨荧光免疫标记物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述交联剂a包括羟基琥珀酰亚胺交联剂；

优选地，所述羟基琥珀酰亚胺交联剂包括3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酸辛二酸戊二酸盐、琥珀酸辛二酸二亚胺或琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸；

优选地，步骤(2)所述结合物A与交联剂a的摩尔比为1:(50-5000)，优选1:(50-500)；

优选地，步骤(2)所述交联剂a活化结合物A的温度为4-37℃，时间为0.5-2h；

优选地，步骤(2)所述交联剂b包括巯基交联剂；

优选地，所述巯基交联剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或乙醇胺；

优选地，步骤(2)所述生物特异性结合反应物与交联剂b的摩尔比为1:(50-5000)，优选1:(50-500)；

优选地，步骤(2)所述交联剂b活化生物特异性结合反应物的温度为4-37℃，时间为0.5-2h。