[发明专利]一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法

说明书

本发明公开了一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，通过将样品用蒸馏水超声提取的提取液用大孔吸附树脂柱层析进行分离，用蒸馏水和不同浓度梯度的乙醇溶液进行梯度洗脱，按极性不同收集洗脱液，浓缩得各干膏状样品；采用体外乙酰胆碱酯酶抑制活性的检测方法考察各干膏状样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，并选择强活性的洗脱部位作为供试品溶液；将供试品溶液与乙酰胆碱酯酶孵育后通过超滤薄膜，以磷酸盐缓冲液配合离心清洗超滤薄膜并弃滤液；以有机溶剂配合离心清洗超滤薄膜并收集滤液，从该滤液中最终分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂。本发明方法具有快速、高效、灵敏度高、样品/酶消耗量低、高通量以及目标受体可以多次反复使用等特点。

技术领域

本发明属于药物分析化学领域，尤其涉及一种从天然药物中高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是老年人最常见的痴呆形式，以丧失记忆和认知功能为特征，严重影响着人类的身体健康和生活质量。根据《2018年世界阿尔茨海默病报告》指出，估计全球有4400万人患有痴呆症，预计到2050年，全球阿尔茨海默病发病率将增加两倍，AD已成为继肿瘤、心脏病、脑血管病之后引起老年人死亡的第4大病因。研究表明，AD患者中除1％～5％的病例发生基因突变外，人们普遍认为AD患者的认知障碍是由于大脑皮层和某些皮质下区域胆碱能神经元的丧失，由此导致的胆碱能神经传递的损伤。目前，大多数可用的药物是乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEIs)，FDA批准上市的抑制剂有多奈哌齐、加兰他敏、利斯的明和塔克林。虽然，它们是临床上最常用的缓解AD症状的药物，但是，这些药物疗效有限、价格昂贵、并易引起患者胃、肝和肠道等不适的副作用，严重地制约了其应用。

乙酰胆碱酯酶(AChE)是羧酸酯酶家族中的一种水解酶，其功能是水解突触间隙中的神经信号信使乙酰胆碱(ACh)，进而导致胆碱能神经传递的终止。20世纪70年代中期出现的“胆碱缺乏假说”认为，基底前脑投射到皮层和海马的胆碱能神经元的丧失，也以胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱能神经元(ACh)的减少为标志，是AD记忆丧失和认知障碍的原因。因此，抑制乙酰胆碱酯酶可增加海马中乙酰胆碱的含量，使海马M1型乙酰胆碱受体激动化，从而导致与淀粉样前体蛋白加工、神经保护、学习记忆相关的下游调控。因此，乙酰胆碱酯酶被认为是干预阿尔茨海默病重要的药物靶点之一。

近年来，从天然药物(如中药)中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂，已经成为了医药领域的研究热点，如研究表明花椒叶提取物、人参根茎提取物和黄连提取物等对乙酰胆碱酯酶(AChE)具有显著的抑制作用，以及石杉碱甲(天然植物碱)是一种有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，在中国已被证明用于治疗阿尔茨海默病。目前，国内外在乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究方面，主要是体外乙酰胆碱酯酶抑制活性和体内动物模型的研究方法，考察样品粗提物对乙酰胆碱酯酶的抑制情况。然而，该方法只能得出样品粗提物是否有抑制活性，以及抑制性的强弱，无法明确到具体是哪一类或哪一种药效成分具有抑制作用；并且，如果已知了活性成分的信息，仍需要进行多次的分离纯化，工艺繁琐复杂，样品和溶剂消耗量大，劳动强度大，且不适用于多种成分的同时筛选。

因此，建立快速、高效、高灵敏度、低样品消耗、高通量的方法，从天然药物提取物中同时筛选和鉴定多种乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，具有重要的科学价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从天然药物中高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，旨在解决现有乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方法存在的工艺繁琐复杂、样品和溶剂消耗量大、劳动强度高、不适用于多种成分的同时筛选等问题。

本发明是这样实现的，一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将100g样品用600mL蒸馏水超声提取1～2次，合并提取液并浓缩得浸膏；将浸膏用100mL～150mL蒸馏水溶解后转移到大孔吸附树脂柱层析进行分离，用蒸馏水和不同浓度梯度的乙醇溶液进行梯度洗脱，按极性不同收集洗脱液，浓缩得各干膏状样品；