[发明专利]一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法

权利要求书

1.一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法，其特征在于，所述的分析方法具体包括以下步骤：将长余辉纳米粒子进行表面肠毒素抗体修饰得到ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液，与金锥纳米粒子进行表面肠毒素抗体修饰得到的Au NBPs@4-ATP/SEC-2溶液混合，随后加入肠毒素SEC，混均，分别测定溶液荧光光谱以及拉曼光谱，所述分析方法的具体步骤如下：

(1)长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的制备及表面SEC-1的修饰：

①长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的制备：

将Cr(NO₃)₂，Zn(NO₃)₂，Yb(NO₃)₂，Er(NO₃)₂与锗酸铵溶液加入到Ga(NO₃)₂溶液中，混匀后得到溶液1，随后向溶液1中加入CTAB，调节溶液的pH值至7-9，混均后进行水热反应，在110-130℃下加热14-16h；冷却至室温后，固液分离取沉淀物，洗涤并干燥即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs；

②长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的氨基化：将上述所得ZGGO:Cr,Er,Yb NPs分散于NaOH溶液中，混均后固液分离取沉淀，并将其分散在N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES试剂，在75-85℃水浴中加热，待反应结束后固液分离取固相，并将固相分散在水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；

③长余辉纳米粒子表面肠毒素抗体(SEC-1)修饰：将戊二醛和NaBH₄溶液加入到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液中并搅拌，之后固液分离并洗涤沉淀物，将沉淀物用PBS缓冲溶液复溶，加入SEC-1溶液，振荡孵育，离心并用BSA溶液重悬产物，室温下保存4-5h，反应结束后收集沉淀物并用水清洗，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，反应结束后即得ZGGO:Cr,Er,Yb/SCE-1溶液；

(2)金锥纳米Au NBPs溶液的制备及表面SEC-2的修饰：

①金锥纳米Au NBPs溶液的制备：首先向HAuCl₄，十六烷基三甲基氯化铵CTAC，柠檬酸溶液中加入NaBH₄溶液，室温搅拌1-3min；将溶液在75-85℃油浴中加热搅拌85-95min得到金种溶液，向CTAB、HAuCl₄、AgNO₃、HCl与AA抗坏血酸的混合溶液中加入上述金种溶液，并孵育1.8-2.2h得到金锥纳米Au NBPs溶液；

②Au NBPs@4-ATP的制备：向金锥纳米Au NBPs溶液中加入4-ATP溶液，反应结束后固液分离取固相并用水洗涤，将固相溶解在水中得到Au NBPs@4-ATP溶液；

③表面肠毒素抗体SEC-2的修饰：将用TBE缓冲液稀释的肠毒素抗体SEC-2加入AuNBPs@4-ATP溶液进行反应，待反应结束后固液分离取沉淀物，用BSA溶液重悬沉淀物，室温下保存2-3h，封闭未结合抗体的结合位点；反应结束后离心收集沉淀物并用水洗涤，最后将沉淀物重新分散在PBS缓冲溶液中，即得Au NBPs@4-ATP/SEC-2溶液；

(3)荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：

将Au NBPs@4-ATP/SEC-2溶液与配制好的SEC标准溶液混合，室温下孵育5-6h；之后加入ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液，室温下孵育5-6h；反应结束后用250-260nm紫外灯照射，测试每组溶液的发光光谱，得到以SEC浓度对数为横坐标，以检测探针ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1的发光恢复程度F-F₀纵坐标的标准曲线；测试每组溶液的拉曼光谱，得到以SEC浓度对数为横坐标，以检测探针Au NBPs@4-ATP/SEC-2的拉曼信号变化程度I-I₀为纵坐标的标准曲线，其中所述F代表有肠毒素时的荧光强度；I代表有肠毒素时的拉曼强度；F₀代表没有肠毒素时的荧光强度；I₀代表没有肠毒素时的拉曼强度。