[发明专利]一种提高核酸稳定性的保存液及其应用

说明书

本发明公开一种提高核酸稳定性的保存液及其应用，本发明所述的保存液，包括10mM～500mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1～20mg/ml的非离子表面活性剂、1mM～0.5MEDTA、10mM～500mM无机盐、0.1～20mg/ml山梨糖醇中的一种或几种。本发明所述的保存液不仅可以直接用于后续提取步骤，不需要离心去除，不仅不影响硅胶质膜和磁珠对核酸的吸附，且可以促进后续核酸提取时核酸对离心柱和磁珠的吸附作用，提高提取得率并节约时间。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高核酸稳定性的保存液及其应用。

背景技术

微生物(microorganism)是存在于自然界的一群体形微小、结构简单的微小生物。微生物肉眼不可见，必须借助光学显微镜或电子显微镜进行放大才能观察到。微生物在自然界是广泛存在的，其中，有一部分微生物可以侵犯人体引起感染导致传染病，这类微生物被称为病原微生物。病原微生物包含朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒，其中，以细菌和病毒的危害性最大。

病原微生物侵入人体后，人体就是病原微生物生存的场所，医学上称为病原微生物的宿主。病原微生物在宿主中生长繁殖、释放毒性物质等引起机体不同程度的病理变化，这一过程称为感染。病原微生物感染宿主后，通过不断繁殖、变异和进化，增强自己的毒力或致病力，进而引发机体的免疫排斥反应，当超过机体自身正常生理承受范围，则表现出症状，引发疾病甚或是严重的传染和感染性疾病。由病原微生物引起的传染和感染性疾病是临床面临的最常见的疾病之一，约占常见疾病的50％。病原微生物因为繁殖快、核酸不稳定导致高度易变异，因而使得病原微生物呈现多样性；此外，随着人群结构的变化、环境污染以及药物滥用等因素的影响，使得病原微生物导致的疾病呈现复杂化的趋势，严重威胁人类健康。

目前，常用的针对病原微生物检测方法包括涂片镜检、生化反应、免疫检测、培养法、常规PCR法、qPCR、基因芯片技术、高通量测序(NGS)、质谱等技术；其中，基于核酸的检测，因为其高灵敏度、高准确率以及快速等特点，而成为确诊的金标准，包括上述介绍的、常规PCR法、qPCR、基因芯片技术、高通量测序(NGS)等方法。

核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类,已知核酸是一切生物体的遗传物质,在细胞主要存在于细胞核内,在病毒存在于病毒衣売内。核酸因为很容易被环境中存在的核酸酶分解，因此在一般的环境下能完整保存的时间很短；特别是RNA保存难度更大,一方面，因为RNA是单链，极其不稳定，另一方面，常规的实验环境中广泛存在RNA酶(RNase)，且Rnase非常稳定，难以去除。因此，如何从样品中得到高品质及完整的核酸一直是生物领域亟待解决的问题。

在核酸保存方面，美国Ambion公司(现为Thermo Fisher公司收购)开发了一种可保存完整细胞的溶液RNAlater，该产品由柠檬酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)与硫酸铵组成。RNAlater保存的核酸样品在37摄氏度下可稳定保存一天，不会明显降解。此外，胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍等)作为一种经典的蛋白变性剂，常用于核酸提取中的细胞裂解，因而，市场上有很多基于胍盐开发的核酸保存液。

在核酸提取方面，目前，传统方法是酚/氯仿有机溶剂抽提，硅胶膜吸附离心柱法以及兼容自动化平台广泛应用的磁珠法核酸提取方法。酚/氯仿提取的原理主要是苯酚使蛋白质变性，同时抑制了核酸酶的降解作用；氯仿可以制造分相，蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。此外，在提取过程中经常加入异戊醇促进分相，并通过降低表面张力，去减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，维持分相稳定。离心柱法采用的硅胶质膜经过修饰，表面带有大量的阴离子基团，在高盐低pH时，可以高效吸附核酸。磁珠法核酸提取采用的是超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体,通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸，而不吸附蛋白和其他杂质；在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附，从而达到快速分离纯化核酸的目的。目前，离心柱纯化法和磁珠纯化法因为其提取的纯度高、产量高，受人为操作因素影响小，可以兼容自动化(磁珠法)而得到广泛应用。