[发明专利]一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法

权利要求书

1.一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，包括免疫荧光探针、检测基板以及被检测样品；

所述免疫荧光探针为通过在高浓度稀土掺杂上转换纳米材料颗粒表面修饰免疫检测所需要的生物活性分子A得到；

所述检测基板为通过在基板上修饰用于捕获被检测物的生物活性分子B；

所述被检测样品中含有被检测物，所述被检测物为病原体、微生物、大分子抗原或抗体；

所述被检测物为病原体、微生物或大分子抗原时，生物活性分子A为可与被检测物特异性结合的抗体A，生物活性分子B为可与被检测物特异性结合的抗体B；所述被检测物为抗体时，生物活性分子A为可被被检测物特异性识别的抗体A，生物活性分子B为可被被检测物特异性识别的抗原；

在检测时，将被检测样品用缓释液稀释后滴加到检测基板上，被检测物与生物活性分子B结合，完成后冲洗检测基板，然后滴加用缓释液稀释的免疫荧光探针，使生物活性分子A与已经和生物活性分子B结合的被检测物结合，完成后冲洗检测基板，洗去未结合的免疫荧光探针；将前述处理后的检测基板置于荧光显微镜下，使用近红外光作为激发光源，可见光波段作为检测波段，对整个检测基板进行荧光成像，对免疫荧光探针数目进行计数，所得数目即为被检测样品中被检测物的数目。

2.如权利要求1所述一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，所述高浓度稀土掺杂上转换纳米材料颗粒中稀土掺杂比例大于2%。

3.如权利要求1所述一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，所述高浓度稀土掺杂上转换纳米材料颗粒的粒径为10-100nm。

4.如权利要求1所述一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，所述检测基板为对基板醛基化修饰后修饰。

5.如权利要求4所述一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，所述基板为玻璃片或硅片。

6.如权利要求1所述一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，所述激光光源的波长为790nm、980nm或1550nm，所述激光光源通过显微镜光路的能量密度大于1W/cm²。

7.如权利要求1所述一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，所述免疫荧光探针是以NaYF₄、NaGdF₄、CaF₂、LiYF₄、NaLuF₄、LiLuF₄、KMnF₃或Y₂O₃为发光基质，与敏化剂和激活剂共掺杂后得到上转换荧光纳米颗粒UCNPs，然后对UCNPs颗粒表面经羧基化修饰得到羧基化修饰纳米颗粒UCNP@PEG-COOH，再由生物活性分子A修饰得到荧光探针。

8.如权利要求1所述一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，其特征在于，所述缓释液为质量浓度为0.2mol/L的PB缓冲液，所述PB缓冲液中溶质按质量百分比包括0.1%BSA、2%蔗糖、0.1%Tween。