[发明专利]一种基因编辑的载体和方法

说明书

本发明公开了基因工程技术领域的一种基因编辑的载体和方法。所述载体通过增加pegRNA表达框数量，使用聚合酶II和聚合酶III启动子共同驱动pegRNA，并结合tRNA和RNA核酶的表达策略构建而成，使用本发明的载体，进行基因编辑，尤其是植物基因编辑，可以显著提高先导编辑的效率，提高精准编辑效率。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因编辑的载体和方法。

背景技术

精确的基因组编辑技术在作物育种和基因组功能研究中发挥着重要作用。尽管近年来基因编辑技术取得迅速进展，但精确编辑在植物中仍面临巨大挑战。最近，先导编辑系统(Prime Editing)在哺乳动物细胞中被开发和测试(Anzalone,Randolph et al.Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA 2019)。第一代先导编辑系统(PE1)由野生型逆转录酶(M-MLV)和Cas9切口酶(H840A)的融合蛋白以及先导编辑引导RNA(pegRNA)两部分组成，其中先导编辑引导RNA由单链引导RNA(sgRNA)在其3’末端增加一段含有新遗传信息的逆转录模板(rtT)和引物结合位点(PBS)的序列获得；在PE1系统的基础上，优化M-MLV逆转录酶建立PE2系统；在PE2系统的基础上，引入切割非编辑链的sgRNA建立PE3和PE3b系统，其效率有明显提升。动物细胞中，PE系统在不引入双链断裂(DSB)和无需供体DNA模板情况下，可有效实现12种单碱基的自由转换和多碱基的精准插入与删除。

2020年3月以来，国内已有多组科研团队相继发表文章阐述该先导编辑系统在植物水稻中的应用。结果表明，在植物中原始PE系统确实可以实现各种类型的精准编辑，也可以获得具有目标编辑的转基因材料，但其编辑效率却远不如哺乳动物细胞(Lin,Zong etal.2020)。因此，需要在植物(尤其对于遗传转化较难的物种)中开发出一种能显著提高先导编辑效率的方法，以提高该系统的可用性和友好度。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明的目的之一在于提供一种基因编辑的载体。

所述基因编辑的载体包括：先导编辑系统，所述先导编辑系统包括针对特定编辑位点的pegRNA系统和PE融合蛋白基因，所述PE融合蛋白基因由Cas9基因和逆转录酶基因融合而成，所述针对特定编辑位点的pegRNA系统包括针对至少一个特定编辑位点的pegRNA基因，所述每个pegRNA基因至少设置2个表达框进行重复表达。

上述载体中，所述PE融合蛋白基因中：所述Cas9基因，优选的，为SpCas9切口酶(H840A)基因或者优化的SpCas9切口酶(H840A)基因，所述逆转录酶为鼠白血病病毒M_MLV逆转录酶或优化的鼠白血病病毒M_MLV逆转录酶；

例如，所述PE融合蛋白基因的序列为序列表中SEQ NO.1所示的核苷酸序列第2006位～第8359位；其中Cas9为密码子优化的SpCas9切口酶(H840A)，位于SEQ NO.1所示的核苷酸序列的第2063位～第6163位；逆转录酶为优化的鼠白血病病毒M_MLV逆转录酶，位于第6263位～第8293位。

上述载体中，每个所述pegRNA基因的至少一个所述表达框由双启动子驱动，进一步的，所述双启动子为聚合酶II和聚合酶III启动子共同驱动。

例如，所述聚合酶II和聚合酶III启动子为CmYLCV启动子(Cestrum yellow leafcurling virus，夜香树黄曲叶病毒)和U6-26启动子(已去除其5’端的潜在终止子序列，可称之为U6启动子)；

例如，所述聚合酶II和聚合酶III启动子为ZmUbi1和OsU3。