[发明专利]一种可视化检测植物细胞水平无机磷分布的方法

说明书

本发明公开了一种可视化检测植物细胞水平无机磷分布的方法。该方法包括：将待测植物样本制作成切片；将切片置于无机磷染色液中染色；将染色后的样本置于固定液中固定；如果待测样本有色，则将固定后样本置于储存液中脱色，然后透明；如果待测样本无色，则直接将样本置于透明剂中透明；镜检。本发明将钼蓝染色法和水合氯醛法结合起来，在保持植物组织和细胞完整的情况下，在植物组织和细胞水平显示植物体内无机磷的分布，其具有周期短，操作简单，不需要昂贵设备的优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可视化检测植物细胞水平无机磷分布的方法。

背景技术

磷是植物得以生存的必需元素，植物根系通过吸收土壤中的无机磷(Pi，-HPO₄^2-和-H₂PO₄^-)来满足自身对磷的需求，而且无机磷是植物细胞中最灵活，最易移动和最主要的存储形式。但由于磷在土壤中的化学特性，如低溶解度，扩散速度慢和容易被土壤中的金属离子Al³⁺，Fe³⁺，Ca²⁺等固定，导致其成为限制作物产量的重要因素之一。为了应对低磷环境，植物的不同组织细胞也进化出不同的适应机制，导致植物中磷的分布模式各不相同。然而目前对于植物磷信号和磷平衡调控主要停留在器官水平，如植物的地上部和根部，导致错过很多细节信息，成为深入了解植物磷信号和磷平衡精细调控机制的限制因素。已经有一些研究方法如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)，电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)，二级电离质谱法(SIMS)，纳米SIMS(nanoSIMS)，激光烧蚀ICP-MS(LA-ICP-MS)及³¹P-核磁共振(NMR)等方法应用于检测植物体内的磷的分布。但这些检测方法都耗时耗力，且需要大型昂贵检测仪器，不能满足大部分实验室的需求。

钼蓝染色法是一种测定磷酸盐的经典方法，其作用原理是：在酸性介质中，磷酸盐与钼酸铵反应生成磷钼黄，在抗坏血酸的还原作用下成为磷钼蓝而呈现蓝色，通过分光光度计测定其吸光值可知其无机磷含量。因为它操作简单，成本低，特异性好成为实验室最为常用的检测植物无机磷含量的方法。已有研究报道，无机磷(phosphate，Pi)是植物体内波动最大，移动最快的含磷分子(Kanno et al.,2016)，是植物体内磷的主要储存方式，然而目前对植物无机磷的研究还停留在组织水平的含量上，还没有细胞水平可视化检测无机磷分布的原位检测技术。

发明内容

本发明的目的是找到一种简单、高效、经济、高分辨率的方法，可实现无机磷在植物不同组织和细胞中的分布可视化。为此，本发明开发了一种可视化的无机磷染色技术IPSA(Inorganic Phosphorous Staining Assay)，在细胞水平上原位检测植物无机磷的分布。

本发明要求保护一种原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布的方法。

本发明所要求保护的原位检测植物组织和/或细胞中无机磷分布的方法，可包括如下步骤：

(1)将待测植物样本制作成切片；

(2)将切片置于无机磷染色液中进行染色；

(3)将染色后的样本置于固定液中进行固定或不固定；

(4)将步骤(3)样本置于储存液中进行脱色或不脱色；

(5)将步骤(4)样本置于透明剂中进行透明，直至样本完全透明；

(6)镜检。

在步骤(3)中，如果所述待测植物样本为幼嫩无颜色样本(如幼嫩无色素根)，则可不进行固定处理。

在步骤(4)中，如果所述待测植物样本为有颜色的样本(如叶片)，则将固定后的样本置于储存液中进行脱色，脱色后进行步骤(5)；如果所述待测植物样本为无颜色样本(如无色素根)，则可将步骤(3)样本直接进行步骤(5)。