[发明专利]研究GNL3与肝癌发展的相关性的方法及GNL3作为肝肿瘤干细胞、肝癌标志物的用途

权利要求书

1.一种利用研究GNL3、GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验获取GNL3在肝癌发展过程中的表达变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、检测非肝癌组织与肝癌组织中的GNL3表达，验证GNL3在肝癌发生中的特异性表达；

S2、基于S1获得的GNL3特异性表达结果，构建GNL3-GFP小鼠模型种群，包括注射肝致癌物的实验组和不注射肝致癌物的对照组；

S3、分别获取步骤S2获得的小鼠模型于多个时间点的肝脏样本，研究GNL3⁺在肝癌发展过程不同时间点的表达情况和分布，并记录不同表达率对应的时间点；具体包括：从第6个月起，分5个时间组即第6、7、8、9、10个月，收集实验组和对照组的小鼠肝脏标本进行免疫组化实验：标本用2%PFA液进行冲洗及灌注，并固定于4%PFA液中过夜；石蜡包埋后，切片厚度为5um，做免疫组织化，用Ab₁138检测GNL3，同时流式细胞分析，检测GFP及内在GNL3蛋白的表达情况；

S4、在以获得特定GNL3⁺表达率的最佳时间点收取实验组小鼠肝脏样本，并进行GNL3⁺肝肿瘤干细胞和GNL3^-非肿瘤干细胞的分离；所述最佳时间点为肝癌恶化进程中GNL3⁺阳性表达率在20%-25%的时间点；

S5、验证GNL3⁺为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记，并检测GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞的特性、功能；

步骤S5中采用体外移植实验验证GNL3⁺为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记，分别将GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞和GNL3^-非肝脏肿瘤干细胞注入健康小鼠肝脏并检测对应小鼠肝脏致癌情况，依据GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞的致癌效果验证GNL3为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记；步骤S5检测GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞的特性、功能包括利用细胞克隆形成实验检测GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞的致癌能力、利用Q-RT-PCR实验检测并比较GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞的分子谱和其他肝脏肿瘤内干细胞的分子表达、利用RNA-Seq检测比较GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞与GNL3^-非肝脏肿瘤干细胞分子特性的差异。

2.根据权利要求1所述的一种利用研究GNL3、GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验获取GNL3在肝癌发展过程中的表达变化的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：

S11、在小鼠出生特定时间间隔后注射肝致癌物；

S12、获取步骤S11所得注射后小鼠特定生长时期的肝脏标本，所述特定生长时期包括非肝癌时期和肝癌时期；

S13、对步骤S12获得的肝脏标本进行切片染色，染色包括HE染色、Ki67免疫组化染色、针对GNL3⁺的GNL3抗体免疫组化染色；和/或，进行Q-RT-PCR检测分析，获取GNL3⁺细胞与GNL3转录的相关性。

3.根据权利要求1-2任一项所述的一种利用研究GNL3、GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验获取GNL3在肝癌发展过程中的表达变化的方法，其特征在于，

所述GNL3-GFP小鼠模型种群构建过程包括以下步骤：

S21、构建GNL3-GFP小鼠模型，传代和繁殖至特定数目后进行分组，每次试验分为多个时间小组，且每个时间小组需同等数量的实验组、对照组小鼠，所述特定数目与所述试验次数所需总数目对应；

S22、所述实验组使用DEN对14-15天龄小鼠进行腹腔注射以诱导肿瘤生长，并于第28天开始，对小鼠进行TCPOBOP注射，每2周1次，总共8次，以促进肿瘤生长；对照组则使用生理盐水腹腔注射；

GNL3⁺肝肿瘤干细胞和GNL3^-非肿瘤干细胞的分离包括以下步骤：

S51、采用流式细胞术从收取到的DEN+TCPOBOP诱导的实验组小鼠的肝癌组织中分离出GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞和GNL3^-非肝脏肿瘤干细胞；

S52、使用磁珠将血液细胞去除，并用流式仪去除死亡细胞；

S53、分开GFP⁺和GFP^-细胞，获得纯化的活的GNL3⁺肝脏肿瘤干细胞和GNL3^-非肝脏肿瘤干细胞。