[发明专利]利用β-1,6-葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的方法及其应用

说明书

本发明涉及利用β‑1,6‑葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的方法及其应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明首先提供了一种利用对龙胆二糖具有转糖基活性的β‑1,6‑葡聚糖酶TcBgn，其可在加酶量较低的情况下将葡萄糖转化为低聚龙胆糖，且转化率高，可显著降低生产成本。本发明还将β‑1,6‑葡聚糖酶与β‑葡萄糖苷酶双酶复配制备低聚龙胆糖，利用双酶复配体系将葡萄糖转化为龙胆二糖和龙胆三糖，转化率高，且显著提高了龙胆三糖在产物中的比重。因而，β‑1,6‑葡聚糖酶单酶或双酶复配制备低聚龙胆糖的方法，均具有较好的工业化应用价值。

技术领域

本发明涉及利用β-1,6-葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的方法及其应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1，6糖苷键连接形成的功能性低聚糖，包括龙胆二糖和少量的三、四糖。低聚龙胆糖不被人体肠道消化吸收，但却有利于双歧杆菌和乳酸菌的繁殖和生长，适合糖尿病等人群食用，其高保湿性能有利于保持食品中的水分，可防止淀粉老化；同时低聚龙胆糖耐热性高，适用于需要高温处理的食品；其成分中的龙胆三糖具有独特的、柔和的柔和的提神苦味，具有良好的保健效果。目前，低聚龙胆糖被广泛运用于巧克力、冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品和饮料中。

低聚龙胆糖酶法生产相关研究主要集中在利用β-葡萄糖苷酶以葡萄糖为底物通过逆水解缩合作用形成产物，但目前报道的β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖生产过程中主要存在三个问题，一是低聚龙胆糖产率低，二是产物中只含有龙胆二糖，未检测到龙胆三糖及更高聚合度的低聚龙胆糖组分，三是用酶成本高。研究资料显示，龙胆三糖和龙胆四糖具有比龙胆二糖更好的促双歧杆菌益生活性。

β-1,6-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)是一种可水解β-1,6葡聚糖的糖苷水解酶，水解终产物为龙胆二糖。然而，部分研究显示，自然界中还存在部分β-1,6-葡聚糖酶对龙胆二糖具有微弱的水解活性，可利用龙胆二糖为底物转苷合成龙胆三糖甚至四糖。如Fujimoto等以聚合度为2～6的低聚龙胆糖为底物测试β-葡聚糖酶时发现，随着聚合度的降低，酶对底物的水解活力也会随之下降，假定对六糖的水解活力为100％，那么对于二糖则不到1％，而只有对二糖具备一定水解活力的酶，才能够以龙胆二糖为底物合成更高聚合度的低聚龙胆糖。由此可见，在目前的生产和研究中，对于如何制备聚合度更高的龙胆三糖仍然是一个亟待解决的问题。

发明内容

为解决目前存在的问题，本发明提出一种利用β-1,6-葡聚糖酶制备低聚龙胆糖的方法及其应用，提高低聚龙胆糖的转化率和产物中龙胆三糖的占比，提升产品品质。

本发明的第一个目的是提供一种利用β-1,6-葡聚糖酶单酶法制备低聚龙胆糖的方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖为底物。

在本发明的一种实施方式中，所述β-1,6-葡聚糖酶是来源于解纤维素蓝状菌Talaromycescellulolyticus的β-1,6-葡聚糖酶TcBgn，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，以70～90％的葡萄糖为底物，β-1,6-葡聚糖酶加酶量为400～1600U/g葡萄糖，在pH 3.5～4.5、温度40～50℃下进行酶反应，反应48～96h。

本发明的第二个目的是提供一种利用β-葡萄糖苷酶和β-1,6-葡聚糖酶协同制备低聚龙胆糖的方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖为底物。

在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶和β-1,6-葡聚糖酶均来源于解纤维素蓝状菌Talaromycescellulolyticus；所述β-葡萄糖苷酶为β-葡萄糖苷酶TcBgl3A；所述β-1,6-葡聚糖酶为β-1,6-葡聚糖酶TcBgn；β-1,6-葡聚糖酶TcBgn的氨基酸序列如SEQ IDNO.1；β-葡萄糖苷酶TcBgl3A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。