[发明专利]细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法及非编码RNA序列

权利要求书

1.一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细粒棘球绦虫原头节和囊液分离；

(2)细粒棘球绦虫原头节体外培养；

(3)细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离，获得原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs；

(4)透射电镜分析；

(5)纳米粒径跟踪分析；

(6)Western blotting；

(7)miRNA文库构建及测序；

(8)全转录组测序文库构建及测序分析；

(9)ceRNA调控网络构建。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，消毒后，用注射器穿刺棘球蚴吸取囊液，置于离心管自然沉降后，将上清转移至新的离心管，收集囊液；沉淀清洗，收集原头节。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将步骤(1)分离的原头节重悬于RPMI 1640完全培养基中，接种于T75的细胞培养瓶中，加入抗生素和葡萄糖置于37℃，5％CO₂培养箱；每12h收集一次原头节培养上清并更换新的培养基，并吸取部分原头节悬液，用1％台盼蓝染色计数判断其活性；将原头节在无血清培养基中培养7d，收集培养上清，-80℃保存。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将收集的原头节培养上清和囊液分别置于离心管内，依次离心，去除大的死细胞和细胞碎片，过滤上清液；将过滤后的原头节培养上清和囊液，超速离心；沉淀用PBS洗涤，并以相同的速度进一步超离心纯化；最后将获得的原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs分别重悬于PBS中，并保存在-80℃下直至使用。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)具体为：吸取纯化的PSC-ELVs和HF-ELVs悬浮液，滴加于铜网上，室温静置吸附1min，滤纸吸去残液后滴加适量的3％磷钨酸于铜网上，负染1min，室温干燥；透射电子显微镜，80kV下曝光以捕获图像。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)具体为：用NanoSight LM10对外泌体进行纳米粒径跟踪分析，以确定PSC-ELVs和HF-ELVs的粒径大小和频率分布。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)具体为：将ELV沉淀与5×SDS和1×PBS混合，100℃煮沸；取蛋白质样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离，然后将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜；含5％牛血清白蛋白的TBS-0.05％Tween 20中封闭1h，将膜与以下兔多克隆抗体，4℃过夜：抗14-3-3zeta/delta，抗烯醇酶和抗CD9抗体；然后用HRP偶联的山羊抗兔抗体，1：5 000，室温孵育30min；ECL蛋白质印迹检测系统对膜进行可视化检测。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)具体包括如下：使用TruSeq SmallRNA Sample Prep Kits进行文库构建，包括连接3’接头、连接5’接头、逆转录与扩增、PCR扩增、cDNA纯化、文库质检、测序、small RNA测序生物信息学分析、靶基因预测和KEGG信号通路分析；从miRNA文库中筛选获得的含量前20的miRNAs，具体序列见表2.3：

表2.3 PSC-ELVs和HF-ELVs中含量前20的miRNAs