[发明专利]肺部基因递送体系及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种肺部基因递送体系及其制备方法与应用，具有高效克服粘液层和细胞膜屏障的能力；RBP与顺式‑乌头酸酐制备得到RC，将聚合物溶液与核酸溶液混合孵育，再加入RC溶液，孵育，得到肺部基因递送体系。将RCDsT纳米复合物用于治疗ALI疾病，肺气道内注射RCDsT纳米复合物后，可有效穿透粘液层，被细胞有效地摄取，从而实现针对ALI的siTNF‑α与RBP的联合抗炎治疗。简而言之，这项工作提供了解决粘液渗透和细胞摄取之间矛盾的另一种方法，为通过肺气道内直接给药的方式治疗ALI提供了一种能够实现短肽/siRNA共递送的新方法。

技术领域

本发明涉及基因荷载和短肽递送领域，具体涉及高效克服粘液层和细胞膜屏障的肺部基因递送体系RCDsT的制备方法与应用，并用于治疗急性肺损伤。

背景技术

利用肺气道给药治疗ALI的策略中由于存在粘液层屏障，传统基因递送体系在满足高转染效率的同时往往无法实现高效的粘液层渗透。现有技术CN102178957A公开了一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统，该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料，包裹干扰目标致病基因的siRNA制成，还公开了上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法；其公开的给药系统可用于运送干扰目标致病基因的siRNA，以发挥RNA干扰作用，抑制致病基因复制，能够在活体内运送siRNA靶向肺呼吸道上皮，是以沉默靶基因为目的发挥相应药效作用的非病毒运送系统。

除细胞膜屏障外，在ALI中进行肺气道内给药后，粘液层对阳离子聚合物介导siRNA的递送体系提出了新的挑战。粘液由杯状上皮细胞分泌，可以快速清除外源物质。此外，粘液层由粘蛋白单体组成，粘蛋白单体通过二硫键相互交联形成网状结构。由于网状结构的孔径大小约为200 ~ 300 nm，大于300 nm的纳米复合物容易被粘液阻塞并迅速清除。因此，粘液层作为除细胞膜外的另一个生物屏障，对肺气道内给药方式递送基因的纳米复合物设置了时间和尺寸上的要求。在粘液渗透的过程中，纳米复合物会与粘液脂质，细胞碎片以及粘蛋白发生相互作用，而粘蛋白由于高度糖基化而带负电。因此，能够有效介导细胞膜渗透的带正电荷的纳米复合物被粘蛋白通过静电吸附困在粘液层中，从而导致体内的抗炎作用减弱。现有技术常用的克服粘液层屏障方法主要为对递送载体的表面进行PEG化修饰，通过减小基因递送体系与粘蛋白之间的相互作用提高其渗透粘液层的水平；然而PEG化修饰后的递送体系也会减小其被细胞摄取的水平，从而无法实现高效的基因转染。现有技术常用的基因递送方法主要为病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体存在免疫原性等安全隐患，非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等效率低；尤其是现有载体在满足高转染效率的同时往往无法实现高效的粘液层渗透。

发明内容

本发明的目的是提供一种肺部基因递送体系RCDsT，用于实现TNF-α siRNA（siTNF-α）和RBP的共递送。本发明的RC/DPLL/siTNF-α（RCDsT）三元复合物能够快速地渗透粘液层；当到达炎症部位的微酸环境中，RC包衣从纳米复合物表面脱落，RBP可以阻断NF-κB的信号通路，实现抗炎的功效；暴露的DPLL/siTNF-α（DsT）二元复合物被巨噬细胞高效摄取并沉默TNF-α的表达，与胞外释放的RBP共同实现急性肺损伤的联合抗炎治疗。

本发明采用如下技术方案：

肺部基因递送体系，所述肺部基因递送体系内层为装载药物的聚合物，外层为负电物质；所述负电物质包括负电聚合物、负电短肽。

本发明中，所述负电短肽由RBP改性得到；所述RBP的氨基酸序列为KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC；肺部基因递送体系RCDsT，其制备方法包括以下步骤，包括以下步骤：将聚合物溶液与核酸溶液混合孵育，再加入RC溶液，孵育，得到肺部基因递送体系RCDsT。

负电物质在制备肺部基因递送体系中的应用；所述负电物质包括负电聚合物、负电短肽；进一步的，RC或者RBP在制备肺部基因递送体系中的应用。