[发明专利]用于新型冠状病毒快速筛查鉴定的引物及试剂盒和用途

说明书

本发明涉及用于新型冠状病毒快速筛查鉴定的引物及试剂盒和用途。公开一种检测SARS‑CoV2病毒的引物组，所述引物组由LAMP引物组成，以SARS‑CoV2病毒S基因、ORF1ab基因检测靶点，利用该引物组进一步开发出一种设备简单、操作简便，灵敏度和特异性高的SARS‑CoV‑2核酸检测方法。本发明的检测SARS‑CoV2病毒LAMP体系在临床检测上表现优异，临床样本检测符合率100％，获得上海市临床检验中心组织颁发的证书，具有良好的市场应用前景。

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，具体涉及筛查鉴定新型冠状病毒的特异性筛查鉴定引物、鉴定方法及鉴定试剂盒。

背景技术

病毒性肺炎多见于冬春季，可散发或暴发流行，临床主要表现为发热、浑身酸痛、少部分有呼吸困难，肺部浸润影。据统计，90％以上的急性呼吸道感染是由病毒引起。主要包括流感病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等，可侵犯上呼吸道的不同部位，引起炎症。冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)。冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径50～200nm。S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)新型冠状病毒属于β属冠状病毒，其遗传物质是单条正义RNA 链。张永振教授团队利用测序技术确定该RNA病毒的基因组，并第一时间公布相关病毒序列 (GenBank MN908947)，近3万个碱基的长度。基于已知基因组序列，最常用的病毒快速检测技术主要有两大类：核酸检测和抗原抗体免疫检测。核酸(DNA或RNA)是病毒的遗传物质，筛选其独一无二的特征核酸序列进行检测即可确定病原体.而病毒作为抗原可激发人体免疫反应产生抗体，抗原抗体特异性相互结合的特性可作为检测的理论基础。

SARS-CoV-2核酸检测可为诊断提供直接证据，在目前最新版本诊疗方案中，SARSCoV-2核酸的检出仍是唯一确诊依据。实时荧光逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测方法是目前针对于 SARS-CoV-2核酸检测的首选方法，如中国疾病预防控制中心就发布了针对于SARS-CoV-2的开放读码框1ab(ORF1ab)和核壳蛋白(N)特异性靶位基因核酸qRT-PCR检测所对应的引物和探针序列。但其有其天然的缺陷，需要昂贵的检测仪器、试剂和专业技术人员，检测成本高，更加无法满足突发事件中基层及现场的快速检测需求。

目前，采用定量PCR的方法对新型冠状病毒进行临床检测的过程中出现了不少问题，例如，出现了临床症状及影像学高度疑似的SARS-CoV-2患者，但核酸检测呈阴性；部分患者需反复数次检测才能确定。究其原因，核酸检测结果的阴阳性，其容易受到样本中来自病人体内不同化学物质的抑制，从而影响检测的灵敏度。尤其是现在临床上已出现没有症状的人群具有传染性的现象，这对于新型冠状病毒传染的管控带来了很大的不确定性。

2000年日本研究人员Notomi等人发明了一种新型的核酸体外恒温扩增特异片段的分子检测技术，即环介导的恒温扩增技术(LAMP)。与传统核酸扩增技术比较，LAMP的主要特点是：灵敏度和特异性高，与PCR相比高出几个数量级。利用外引物和内引物与目的片段6个特异性部位准确结合发生扩增反应，只有当2对引物与目的片段6个区域都匹配时才进行扩增。LAMP扩增结果只有是和否，相比于PCR具更高特异性。检测速度快、扩增效率高，LAMP是恒温扩增反应，无需预先热变性双链DNA，避过PCR退火、复性过程，避免温度循环而造成的时间损失，能够满足临床样本的快速检测需要。加入环引物后，可在30-45分钟内完成反应；设备简单、操作简便：由 LAMP反应只需要如水浴锅、金属浴等恒温器即可完成此实验，不需要购置昂贵的PCR仪，易于推广应用。产物易检测：根据LAMP反应特性，判断产物结果的方法有琼脂糖凝胶电泳检测法、浊度检测法和荧光比色检测法等，其中，浊度检测法基于LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，可根据是否形成白色沉淀来定性判断结果，简单高效。