[发明专利]磷酸化蛋白质、基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系及制备方法与应用

说明书

本发明公开了磷酸化蛋白质、基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系及制备方法与应用；提供了一种蛋白质磷酸化修饰方法，所述磷酸化蛋白质具有蛋白质结构、通过氨基接于所述蛋白质表面的苯硼酸基团和通过硼酸与邻二醇反应接于所述蛋白质表面的三磷酸腺苷；将阳离子多肽溶液和磷酸化蛋白质在碱液中混合，震荡后静置，得到基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系。在肿瘤细胞内低pH值和高浓度的活性氧环境下，苯硼酸和三磷酸腺苷从蛋白质表面脱落，蛋白质与阳离子聚多肽的作用力减弱，从复合物中释放出来，同时恢复活性，杀死肿瘤细胞。

技术领域

本申请涉及磷酸化蛋白质，更具体涉及用于蛋白质胞内递送体系的磷酸化蛋白质。

背景技术

目前市场上所有蛋白药物都是基于细胞外靶点开发的，如细胞膜蛋白（程序性细胞死亡受体1，PD-1；人表皮生长因子受体2，HER2；胰岛素受体等）和分泌蛋白（肿瘤坏死因子α，TNFα；白介素12，IL12；血管内皮生长因子，VEGF等）。这主要是因为蛋白质的大分子性质和亲水性使它不具备渗透细胞膜的能力。然而，约有70%以上的基因组编码蛋白位于细胞内。由于无法渗透细胞膜，这些蛋白很难被“药物化”。因此，近年来人们越来越重视开发简便、高效的胞内蛋白递送体系。

将具有穿膜功能的组分与蛋白共价结合是一种常见的蛋白胞内递送方式。常见的具有穿膜功能的组分包括蛋白质转导结构域、细胞渗透肽、阳离子聚合物以及一些两亲性小分子。功能化修饰后的蛋白具有更优异的穿膜能力，但这样的化学改性策略很难将具有穿膜功能的化学物质修饰到蛋白的特定位点上，改性后蛋白的生物活性可能会不可逆转地降低或改变。因此，人们用各种动态共价键连接蛋白与功能基团。通过动态共价键修饰的蛋白能够在内源或外源性的刺激下释放载荷蛋白，发挥功效。另一种常用的蛋白胞内递送策略是使用递送载体，如脂质体、细胞衍生小泡、无机纳米颗粒、纳米凝胶和聚合物。这些载体一般通过非共价相互作用与蛋白结合。蛋白质是一类电荷性质不确定、体积较大的生物分子，蛋白质表面可与载体结合的位点数量有限。此外，不同蛋白之间等电点、亲疏水性等性质差异很大，因此很难设计具有通用性的蛋白递送体系。

发明内容

本发明通过对蛋白质进行特定的磷酸化修饰，并通过阳离子聚多肽辅助，解决上述问题，可有效穿透细胞膜，且获得的纳米药物粒径小。

本发明采用如下技术方案：

磷酸化蛋白质，由蛋白质、苯硼酸分子、磷酸腺苷制备得到。

基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系，包括上述磷酸化蛋白质与阳离子多肽。

本发明中，蛋白质上的胺基、苯硼酸分子、磷酸腺苷的摩尔比为1∶（1.3～1.8）∶（1.2～1.8），得到的磷酸化蛋白质与阳离子多肽复合后，得到的纳米药物粒径小且稳定性好。

本发明中，磷酸化蛋白质与阳离子多肽的质量比为1∶（0.5～10）。

本发明中，苯硼酸分子为4-羟甲基苯硼酸频那醇羰基咪唑；磷酸腺苷为三磷酸腺苷。

本发明中，阳离子多肽具有如下化学结构式：

本发明磷酸化蛋白质的制备方法为，将苯硼酸分子溶液加入蛋白质磷酸盐缓冲液中，反应得到R-PBA溶液；然后加入磷酸腺苷溶液，反应得到磷酸化蛋白质。

上述技术方案中，反应为室温反应。

本发明基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系的制备方法为，将阳离子多肽溶液和磷酸化蛋白质在碱液中混合，震荡后静置，得到基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系。碱液为碳酸氢钠水溶液。

本发明进一步公开了所述磷酸化蛋白质或者基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系在制备纳米药物，尤其是抗肿瘤蛋白药物中的应用。