[发明专利]高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法及重组病毒

说明书

本发明公开了高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法及重组病毒，所述的方法包括向敏感细胞内导入或表达含有一种不分节段负义RNA病毒基因组的核酸分子，病毒核心蛋白核酸分子、以及双链RNA拮抗因子核酸分子。利用本发明提供的方法，可明显提高不分节段负义RNA病毒拯救效率。本发明还提供了利用所述方法对重组不分节段负义RNA病毒进行核酸置换、缺失、插入等遗传操作，构建侵染性重组病毒。

技术领域

本发明涉及负义RNA病毒遗传操作技术，具体的，本发明涉及一种重组不分节段负义RNA病毒及其产生方法。

背景技术

对病毒基因组序列进行操作和改造利用需借助病毒的反向遗传学体系，其技术关键是构建病毒侵染性克隆（infectious clone），该克隆导入合适的宿主细胞内可产生重组病毒，即实现病毒拯救（recovery）。通常情况下，正义RNA病毒基因组RNA（genomic RNA，gRNA）转录本一旦导入敏感细胞，或直接向细胞中转染cDNA克隆表达病毒gRNA，即可起始病毒蛋白翻译和基因组复制，产生重组病毒。与正义RNA病毒不同，负义RNA病毒的最小侵染单元为核心壳（nucleocapsid, NC），即病毒基因组被核心蛋白（弹状病毒为核衣壳蛋白N、磷蛋白P、RNA聚合酶大亚基L）包裹所形成的核糖核蛋白复合体（ribonucleoproteincomplex, RNP）。对负义RNA病毒而言，无论是其gRNA，还是互补的反基因组RNA（antigenomic RNA，agRNA），其单独导入敏感细胞后均不具有侵染性。因此，重组负义RNA病毒的拯救需要在寄主细胞内同时表达病毒核心蛋白和病毒基因组，包裹形成有生物学活性的核心壳，经病毒mRNA转录、基因组复制和包装后产生有侵染性的重组病毒。

重组负义病毒拯救过程存在一个特殊的反义RNA问题：当向宿主细胞内同时导入或表达病毒gRNA和病毒核心蛋白的mRNAs时，由于病毒gRNA为负义，而mRNA为正义，两者可杂交形成双链RNA。双链RNA的形成将干扰mRNA的翻译活性，同时影响gRNA被核心蛋白所包装（encapsidation），降低核衣壳形成的效率。更为重要是，双链RNA是重要的病原物相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，在真核生物中引发广泛的免疫反应，包括高等脊椎动物中I型干扰素抗病毒反应以及植物和线虫等低等动物的RNA干扰抗病毒反应，严重抑制重组病毒的拯救。