[发明专利]一种高效降解石油烃菌株ETM的分离方法

说明书

本发明公开了高效分离含油废水中的降解菌的方法,其中,前期菌种驯化采用特殊的手段能够消除绝大部分杂菌干扰，分离刷选过程采用特制培养基可以全面高效的分离出石油烃降解菌，测定柴油的降解率采用紫外分光光度法本发明的皮特不动杆菌能够以石油为碳源生长和增,利用自身代谢降解石油,可以有效用于石油废水、石油污染土壤等的治理,不仅石油降解效率高,且操作简单、方便,成本较低。

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，具体的，涉及从石油烃污染环境中分离筛选高效石油烃降解菌的方法。

背景技术

随着地球人类人口的增加，大肆开采自然资源的同时造成大量的石油烃污染，特别是石油开采和生产加工的过程中会产生大量的含有废水，如何处理这些含有废水成为亟待解决的为题。

由于采油的方式、原油的性质、地质条件等，油田出水的性质不尽相同，但差异不大，采用传统物理或化学手段去除污染效率不高、成本过高并且会产生较大的污染。微生物可以利用原油完成自身的生长、代谢，并将原油分解氧化成简单的有机物和无机物，达到净化含有污水的目的。生物法与传统处理方法相比成本更低并且对环境无害。

但现有石油烃降解菌普遍存在降解效率低，适应能力差，与本土微生物相比降解能力不高等缺点，导致废水处理过程中运行成本增加，故障频发、连续运行困难并且处理水质很难达到标准。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种能够从石油烃污染废水中大量分离能够稳定高效去除石油烃的降解菌株ETM的方法。

具体实施方案

取从石油烃污染水体中采集的污染水样,各取10ml将其投入以两个装有50mlLB营养液的250ml摇瓶中进行富集，其中培养温度为35℃转速为160rpm，培养时间为12小时，通过观察发酵液的浑浊度和用紫外分光光度计测量细胞的OD600判断细胞生长情况，其中OD600达到1.1开始将发酵液以2%的接种量转入第二代LB培养基中；以同样的方式观察判断将已长好的发酵液以10%接入到无机盐培养基中，其中温度梯度依次设为 25℃，28℃，31℃，34℃，37℃，40℃，pH 调节至 7.0，柴油浓度 200mg/L，180rpm 条件下振荡培养，培养3d 后测其柴油降解率同时观察细胞发酵液的浑浊度和OD600。同样的方式将发酵液转入第二代培养基中经过三天培养，开始进入菌种的分离阶段。

石油烃降解菌的分离纯化：（1）平板涂布法：取相应的固体培养基加热融化，待冷却到约50℃时倒平板，厚度约3－5mm，放置使冷却至室温，即可进行涂布。取1ml无机盐发酵液于装有9ml生理盐水的试管中进行稀释混匀，同时再从该试管中取1ml稀释液介入下一只装有9ml生理盐水的试管中稀释，用移液枪取稀释混匀完毕后的菌液50ul至于平板中央，将涂布器蘸取酒精后用酒精灯烧过灭菌后置于平板上盖冷却开始将平板上的菌液快速均匀的涂布，用涂布器连续在五块平板上涂布。刚接种的平板先在黑暗中倒置一天，在倒置于光下培养。待长出单菌落后，挑选平板上不同形态的单菌落并编号做好记录。将挑选的菌株介入到用LB培养基制成的斜边中。（2）平板划线法：取相应的固体培养基加热融化，待冷却到约50℃时倒平板，厚度约3－5mm，放置使冷却至室温，即可进行划线。环状接种针灭菌后冷却，蘸适量发酵液，快速在平板上划线。划线的方法采用三划方法，刚接种的平板先在黑暗中倒置一天，在倒置于光下培养。待长出单菌落后，挑选平板上不同形态的单菌落并编号做好记录。将挑选的菌株介入到用LB培养基制成的斜边中。（以上操作均在超净工作台中进行）。

将前期从平板上挑选的不同的菌株从斜面上挑选介入事先配置好的无机盐培养基中，其中无机盐培养基采用不同的氮源：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3、CO(NH2)2。每个培养基加入 200mg/L 的柴油，置于 28℃、180prm 条件下摇床培养，分别在 2，3，4，5，6，7d 后，测定菌株对柴油降解率。通过对柴油降解情况的观察得出筛选的微生物是否能够高效的降解柴油。

实施例1