[发明专利]一种新生抗原免疫原性的测试方法

说明书

本发明公开了一种新生抗原免疫原性的测试方法，通过将多条抗原多肽分为几组，利用单独负载、共同刺激的方式，显著降低了实验的操作复杂度，大幅简化了实验流程的同时，保证了实验结果的准确性，与常规单独负载、单独刺激的方式相比，可通过多条多肽共同刺激T细胞，测试时，只需检测一份T细胞中含有的不同新生抗原多肽特异性T细胞，测试过程得到了显著简化，提高了工作效率，同时降低了测试成本。

技术领域

本发明属于细胞生物学及生物信息学技术领域，涉及一种免疫原性检测方法，具体地说涉及一种新生抗原免疫原性的测试方法。

背景技术

通常，验证新生抗原的免疫原性的方法是从肿瘤患者或健康志愿者的外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，并从PBMC中分选出T细胞，或者从肿瘤组织中分离瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并分选出T细胞；从而对外周血来源的T细胞或TIL来源的T细胞，用酶联免疫斑点法(Elispot)验证新生抗原的免疫原性。对于外周血来源的T细胞，由于其中含有的新生抗原特异性T细胞的频率很低，甚至低于最敏感的实验方法的检测限，通常需要先采用预刺激的方式，即使用抗原呈递细胞(树突状细胞简称DC细胞)提呈一种新生抗原多肽，将其与T细胞共同孵育，刺激这种新生抗原特异性T细胞的增殖后方可进行各种检测，例如，制备新生抗原多肽四聚体，做四聚体流式分析，检测培养之后的T细胞中新生抗原特异性T细胞的比例。但是，四聚体制备费用高昂，而用于制备四聚体的人类白细胞抗原(HLA)单体种类很少，只有HLA A*0201，HLA A*1101，HLA A*3303等少数几种，即只能够制作HLA A*0201，HLAA*1101，HLA A*3303等少数几种HLA分子所提呈的新生抗原所对应四聚体。对于MHC II类新生抗原，目前还不能制备四聚体，也就是说，MHC II类新生抗原无法用四聚体流式的方法验证。另外，肿瘤患者的HLA分型千差万别，四聚体流式检测方法的应用范围很有限。

对于Elispot检测，在准备T细胞阶段，为了避免HLA分子提呈抗原多肽以及TCR对抗原的识别之间的竞争作用，常规做法是，分别用单条新生抗原负载到DC细胞上，与T细胞共孵育，刺激产生针对单条新生抗原的特异性T细胞(单独负载、单独刺激)，这种操作方法过程繁琐，工作量巨大，且所需T细胞数量众多，需采集大量PBMC，耗时耗力；或者通过一份DC细胞负载多条新生抗原多肽，然后与T细胞共孵育，刺激产生针对多条新生抗原的特异性T细胞(混合负载、混合刺激)。

针对TIL来源的T细胞，通常做法是，将算法预测的肿瘤突变位点构建成串联小基因(Tandem minigene，简称TMG)，然后通过电转的方式导入DC细胞，再与T细胞共孵育做四聚体流式或Elispot检测。这种方式需要大量的新鲜肿瘤组织，以用于TIL细胞的培养，但浸润肿瘤组织中的T细胞种类有限，与PBMC中的T细胞相比，种类单一。同时，因为电转过程中DC细胞会大量死亡，需要大量的DC细胞用于电转。这些都是应用过程中存在的限制条件。这个方法在实际操作上技术难度较大，较少被采用。

因此，亟需一种难度低、省时省力、成本低廉的新生抗原免疫原性的测试方法。

发明内容

为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种简便经济、高效准确的新生抗原免疫原性的测试方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明提供一种新生抗原免疫原性的测试方法，其包括如下步骤：

S1、分离获取外周血单个核细胞；

S2、从所述外周血单个核细胞中分离获取CD8阳性或CD4阳性T细胞；

S3、分选得到CD8阴性T细胞或CD4阴性T细胞，并分离得到单核细胞；

S4、将所述单核细胞诱导为DC细胞；

S5、将所述DC细胞分组，并使每组DC细胞负载一条抗原多肽，将负载有抗原多肽的DC细胞与阳性T细胞共培养；