[发明专利]一种吉氏巴贝斯虫PCR检测方法

权利要求书

1.一种吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一，提取待检样品的DNA；

步骤二，利用吉氏巴贝斯虫鉴定特异性引物进行PCR扩增，特异性引物的序列为：

gi.BaB-1:5’-CTCGRCTACTTGCCTTGT-3’；

gi.BaB:5’-CGAARCTGAAAYAACGG-3’；

步骤三，对扩增产物进行电泳检测。

2.根据权利要求1所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述步骤一的具体方法包括以下步骤：

第一步，向样品中加入蛋白酶K，得到混合物；

第二步，向所述第一步中的混合物内加入Buffer AL，混匀后涡旋振荡；

第三步，向所述第二步中的混合物进行孵育；

第四步，向所述第三步孵育后的混合物内加入乙醇，充分混匀使得管壁上的液体沉到管底；

第五步，将所述第四步获得的液体移至核酸纯化柱上，离心，留下固体；

第六步，将所述第五步离心后的固体内加入Buffer AW1，离心，留下固体；

第七步，将所述第六步离心后的固体内加入Buffer AW2，离心，留下固体；

第八步，将第七步的固体再次离心；

第九步，向所述第八步获得的固体内加入Buffer AE或灭菌水，室温静置1min，再次离心，获得DNA。

3.根据权利要求2所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述第三步中孵育的温度条件为56℃，时长为10min。

4.根据权利要求2所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述第五步、所述第六步中离心的转速均为8000rpm，时长均为1min。

5.根据权利要求2所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述第七步中离心的转速为12000rpm，时长为3min。

6.根据权利要求2所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述第八步中离心的转速为12000rpm，时长为1min。

7.根据权利要求2所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述第九步中离心的转速均为8000rpm，时长均为1min。

8.根据权利要求1所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述步骤二的扩增体系为：

反应体系总体积为25μl，反应组分为：8μl的灭菌水、12.5μl的rtaqMix、1μl的gi.BaB-1、1μl的gi.BaB、2.5μl的样品DNA提取液；

gi.BaB-1:5’-CTCGRCTACTTGCCTTGT-3’；

gi.BaB:5’-CGAARCTGAAAYAACGG-3’。

9.根据权利要求8所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述步骤二扩增反应程序为：

第一步，预扩增94℃、时间5min；

第二步，扩增94℃、时间30s；

第三步，扩增60℃、30s；

第四步，扩增72℃、42s；

进行所述第一步至所述第四步35个循环后再扩增72℃延伸5min。

10.根据权利要求1所述的吉氏巴贝斯虫PCR检测方法，其特征在于：所述步骤二扩增产物电泳检测的方法：采取8μl所述步骤三PCR扩增产物，采用1.5％琼脂糖平台，5V/cm电泳30min，当溴酚蓝达到底部时停止，在紫外检测仪观察到671bp的核酸片段，则确定所检测的样品为吉氏巴贝斯虫核酸阳性。