[发明专利]序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法

说明书

本发明涉及植物生产重组蛋白领域，特别涉及序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法。发现CP基因3`端至少50bP的序列对提高目的基因的表达有明显的作用，序列详见表1。在目的基因开放阅读框后保留CP基因3`端50bp的序列，能显著提高目的基因的表达。

技术领域

本发明涉及植物生产重组蛋白领域，特别涉及序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法。

背景技术

随着生物医药技术和产业的不断发展，预计生物制品市场份额将从2016年的25％(2020亿美元)上升到2022年的30％(3620亿美元)。重组蛋白表达式生物制品生产的一个重要组成部分，通过不同的表达平台将目标蛋白大量、稳定的表达并具有相应的生物学功能，最终应用于临床或其他领域。目前，常见蛋白表达平台包括：大肠杆菌、酿酒酵母、杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞等，不同表达平台有各自的优点和缺点。当前，绝大多数生物制药的表达平台是哺乳动物细胞和酵母。但哺乳动物细胞表达成本高，表达量相对较低；酵母表达蛋白折叠和修饰有一定的限制，需要寻求其他新型的表达系统以更便宜、更大量得表达合适修饰和折叠的重组蛋白。

植物是一种光合自养生物，其生长培育成本低、易于大规模培养、基因操作简单、蛋白质在植物体内能正确的折叠且不含对人类有害的病毒，是一种非常有潜力的蛋白表达平台。目前，植物蛋白表达平台主要包括转基因植物稳定表达和植物瞬时表达两种。转基因植物生长周期长且受到国家法规的严格控制，大大限制了其在蛋白表达中的应用。随着科学的发展和技术的进步，植物瞬时蛋白表达平台在蛋白表达中的应用越来越广。植物瞬时表达将目标蛋白表达框插入到T-DNA中，借助农杆菌将T-DNA导入植物细胞中表达，从机理上可以分为：病毒型(virus-based vector)和非病毒型(non-virus-based vector)。病毒型瞬时表达利用植物病毒在植物细胞快速增殖的特征，可以大大提高目标蛋白的表达和积累。目前，烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)和菜豆黄矮病毒(Bean Yellow and Dwarf Virus，BeYDV)等病毒被改造用于植物的瞬时表达用于重组蛋白的表达和生产。

PVX是一种单链正义RNA病毒，基因组约6.4kb。病毒基因组包含5个开放表达框，编码5个蛋白：ORF1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase，RDRP)，三个重叠开放阅读框(ORF2、PRF3ORF4)组成的移动蛋白(Movement Protein，MP)和ORF5编码的外壳蛋白(Coat Protein，CP)(图1)(Hull,2002)。PVX载体相关原件被改造用于植物外源基因的表达，现阶段一般作法是使用花椰菜花叶病毒35S启动子驱动PVX病毒RDRP的表达，保留PVX病毒亚基因组启动子(subgenomic promoter)用于驱动目的基因的表达，目的基因后连接终止子(Mardanova et al.,2017)。另外有其他研究表明PVX病毒CP蛋白对PVX载体的稳定性有重要作用(Chapman,Kavanagh,Baulcombe,1992)。

发明内容

有鉴于此，本发明针对当前PVX植物表达载体进行改进，发现添加一些序列能够显著提高目的基因的表达，提高重组蛋白的产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了CP基因的3`端至少50bP的序列在促进PVX植物表达载体中外源目的基因的表达的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述序列如SEQ ID No.1～3中任一项所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述外源目的基因包括GFP基因。