[发明专利]一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括将荧光蛋白基因和目标基因片段插入到双元载体中，随后转化农杆菌；用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。该方法简化了筛选步骤、缩短了筛选周期、提高了筛选效率。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法。

背景技术

拟南芥是长日模式植物，具有植株形态个体小、生长周期短、结实多的特点，从播种到收获种子一般只需6周左右，每株植物可产生数千粒种子。因此，拟南芥被广泛用于植物遗传学研究。在反向遗传学领域，拟南芥更是起到了举足轻重的作用。例如，可以根据拟南芥的已知基因寻找该基因在其它植物物种中的同源基因，通过构建超表达载体创建超表达突变体、下调表达突变体，或利用基因编辑创建基因敲除突变体，从而进行基因功能验证。目前很多生物学过程的调控通路在拟南芥中研究得相对透彻，因此，其它作物也会借鉴拟南芥已知的调控通路。用目标基因转化拟南芥，有助于对目标基因的功能及分子机理进行研究。

目前拟南芥转基因植株阳性植株的筛选主要是借助转基因载体中的潮霉素抗性基因进行筛选，但是拟南芥的种子量大，容易筛选到一定量的假阳性植株，继而不利地影响纯合植株的筛选以及接下来的基因功能研究。为了避免这种情况，通常会在移栽转基因拟南芥植株后，对其中的标记基因(例如β-葡萄糖苷酶基因(GUS)、潮霉素基因、目标基因等)进行分子水平检测，以明确每株转基因拟南芥植株的真伪。这个过程费时费力。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了荧光蛋白基因作为筛选标记基因在筛选转基因拟南芥阳性植株中的应用。

本发明通过对双元载体进行改造，将荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白，GFP)基因插入到双元载体中，借助转基因载体中的GFP的表达，在潮霉素抗性培养基筛选后、移栽植株前，通过显微镜直接观察拟南芥的部位(例如根部、花瓣或子房)进行GFP检测，从而筛选转基因拟南芥阳性苗。本发明提供的方法一方面可以排除潮霉素筛选中的假阳性苗，另一方面可以省去大规模提取DNA及分子水平检测所需的时间和精力。

在第一方面，本发明提供了一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：

1.将目标基因片段插入到经改造的双元载体中；

2.用步骤1中制备的双元载体转化农杆菌；

3.用经转化的农杆菌转化拟南芥，并继续培养直到收获种子；

4.将收获的种子播种在筛选培养基，以筛选转基因拟南芥阳性苗；

5.出苗后，在荧光显微镜下观察拟南芥阳性苗的部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性苗，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性苗；

其中，所述经改造的双元载体能够表达荧光蛋白；

所述荧光蛋白是例如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)以及它们的增强型荧光蛋白，也可以是本领域普通技术人员熟知的其他荧光蛋白；在一些实施方案中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白；

优选地，双元载体的实例包括但不限于pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pTCK303和pRGEB32载体；在一些实施方案中，双元载体是pCAMBIA1300载体。

在一些实施方案中，目标基因的启动子和编码序列(CDS)通过在公开可得的数据库例如NCBI获得。接下来通过PCR或其他核酸扩增方法扩增目标基因。在一个具体实例中，PCR扩增反应体系如下(总计50μL)：