[发明专利]一种高效促进软骨细胞增殖的方法

说明书

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶三维培养法和生物力学作用高效促进软骨细胞增殖的方法。本发明所述高效促进软骨细胞增殖的方法，以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将软骨细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，形成模拟体内生长环境的三维结构微环境，同时联合周期性牵张力刺激作用，模拟体内微环境承载的动态牵张力作用，促进体外培养的软骨细胞增殖。

技术领域

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶三维培养法和生物力学作用高效促进软骨细胞增殖的方法。

背景技术

关节软骨在关节活动中起重要作用，关节软骨表面光滑，在运动过程中关节软骨的作用是使所受的力量平均分布在了关节之上以减少关节之间的摩擦和起减缓冲击力的作用，它的结构非常精细和科学，以适应不同的功能需要。关节软骨损伤是常见的一种损伤，由于不正确运动姿势和长年累月的损耗中，关节软骨受到损伤甚至逐渐失去活性。关节软骨引起的症状在临床上表现为关节的疼痛、红肿等，这一系列的临床反应也使关节软骨的功能退变加快。由于软骨结构的特殊性缺乏血管神经等组织，使得关节软骨在自我修复的过程之中会受到诸多限制，导致在关节软骨损伤的症状中，其临床表现出的症状只能减轻，对于完全的康复目前还做不到。在传统的治疗手段是切除坏死组织或者移植相对应的组织，这种作法的成本较高，并且恢复的效果也不尽人意。因此，在临床医学上的对于关节软骨损伤的治疗一直是待解决的难题。

由于在软骨受到损伤时，软骨细胞可以通过迁移到损伤的区域自动修复损伤软骨，而得益于软骨细胞具有向软骨组织不同原始细胞的能力、且可分泌多种细胞因子和细胞外基质，在临床治疗软骨损伤方面有着潜在的应用价值和前景。因此，通过体外培养具有高生理活性的软骨细胞，并促进其增殖、分泌细胞外基质等功能，对于临床应用软骨细胞治疗软骨损伤具有重要的意义。

研究表明，在体外建立模拟体内的三维生长环境，并给予软骨细胞生理性周期性牵张力作用，可以促进软骨细胞的增殖、分泌细胞外基质作用，尤其是体外建立适合细胞生长的生理微环境对软骨细胞行为及生理功能具有重要影响。目前，体外软骨细胞的培养主要分为普通培养法和三维培养法两大类别，其中，普通培养法由于缺少三维结构支撑，培养的软骨细胞处于贴壁状态，无论是在细胞的形态特征、基因表达、生长能力等方面都与体内自然生理环境生长的细胞想去甚远，而给予周期性牵张力作用时，难以实现细胞全方位受力而出现受力不均的情况，不利于软骨细胞在椎间盘组织修复和软骨组织再生中的应用，以及医学组织工程学的研究。

三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术可提供类似体内生长环境的三维支架或基质，模拟细胞生长的体内生理环境，形成三维生长架构，促进细胞建立起细胞间及细胞与细胞外基质的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动。目前，软骨细胞的三维培养法主要包括海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶及Matrigel凝胶法。其中，海藻酸钙凝胶法虽然操作时条件温和，对活细胞损伤小，但固定后却存在机械强度不高的缺陷；琼脂糖凝胶虽具有较大的空隙，允许大分子物质自由扩散，却更适合培养悬浮细胞；Matrigel凝胶法存在步骤复杂、成本较高的缺陷，并且无法在生理环境的不同生物力学状态下保持长时间的高度凝胶状态，导致三维基质结构容易破坏，培养的软骨细胞粘附能力较差，从而失去三维结构的支撑，细胞与细胞或细胞外基质的相互作用减弱，影响到细胞的生长功能，不利于模拟体内生理性生物力学环境下，软骨细胞生长的研究。

另外，由于软骨组织本身具有一定的强度和弹性，这对于关节的生理功能、保持关节运动过程中的稳定性具有重要的作用，而且，由于体内生理环境下或关节运动过程中，软骨组织承受更多的生物应力作用，也使得一般状态下的三维培养方式对于软骨细胞的增殖，并非是最理想的培养方试。

发明内容