[发明专利]一种靶向Trypsin-9基因的miR-283-3p及其应用

说明书

本发明公开了一种靶向Trypsin‑9基因的miR‑283‑3p及其应用，所述miR‑283‑3p序列如SEQ ID NO:1所示，Trypsin‑9基因序列如SEQ ID NO:2所示。并验证了miR‑283‑3p负调控Trypsin‑9的表达，进一步利用SDS‑PAGE电泳检测了高表达和抑制miR‑283‑3p的表达后，中肠液对原毒素Cry1Ac的活化作用，明确了miR‑283‑3p靶向Trypsin‑9可介导原毒素Cry1Ac的活化作用，可应用miR‑283‑3p作为分子靶标来防控小菜蛾等十字花科蔬菜害虫。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，更具体地，涉及一种靶向Trypsin-9基因的 miR-283-3p及其应用。

背景技术

微小RNA(miRNA，microRNA)是一类由基因组编码产生的21～24nt的非编码单链小分子RNA。在生物体中广泛存在，参与细胞增殖、分化、发育、代谢、凋亡等多种生理活动。它们由RNA聚合酶转录出初始转录本(pri-miRNA)，pri-miRNA在内切酶(Drosha)的剪切下形成70-100nt茎环结构的前体miRNA (pre-miRNA)，在Ran-GTP的介导下，转运蛋白Exportin5将前体miRNA转运到细胞质中，后进一步被内切酶Dicer剪切形成22nt的未成熟的双链RNA(imperfect miRNA)，再与具有Dicer酶和解螺旋酶活性的AgoⅠ蛋白结合，双链被裂开，一条被降解，而另一条形成成熟的miRNA后参与沉默复合体 (RNA-induced silencingcomplex，miRISC)的形成。通过碱基互补配对的方式和mRNA结合，在转录后水平对靶基因进行负调控从而降解mRNA的转录，或者抑制mRNA翻译成蛋白。

随着克隆和高通量测序技术和以及生物信息学的飞速发展，掀起了生命科学领域miRNA研究的研究热潮。目前鉴定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息学软件预测，如miRanda，TargetScan和TargetScanS，RNAhybrid， DIANA-microT，PicTar等。由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，利用生物学实验方法可以进一步证明miRNA与靶基因的调控关系。

目前鉴定miRNA与靶基因的关系。主要包括三最直接的方法是，利用荧光定量PCR的方法在mRNA水平上检测miRNA及mRNA的表达水平从而确定 miRNA与靶基因的对应关系。而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法。其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将筛选的miRNA靶基因的片段构建到荧光素酶基因的3’UTR中，然后将荧光素酶基因表达质粒转染细胞，通过咋细胞水平上添加miRNA的抑制剂或模拟物。检测荧光素酶的活性水平反应转染的片段中是否含有miRNA的靶位点。而体内进一步鉴定靶基因的方法是，直接向生物体注射或者饲喂miRNA模拟物mimic或者抑制物inhibitor，后利用荧光定量PCR的方法检测靶基因的mRNA表达水平，来确定miRNA与靶基因的靶标调控关系。对棉铃虫幼虫饲喂ha-miR-2002b mimics使其过表达处理后发现其靶标基因Ha-TLP转录水平急剧下，同时幼虫的生长发育收到影响；相反饲喂miRNA抑制剂inhibitor后转录水平显著上调，说明miRNA通过靶向 Ha-TLP来调控棉铃虫的生长发育。

昆虫胰蛋白酶由中肠肠壁细胞产生分泌进人中肠，主要在取食期的幼虫中肠中被检测到，是昆虫碱性中肠环境中主要的一种丝氨酸蛋白酶(董育新等，1998)，在蛋白的消化和Bt毒素的毒性调节中起重要作用。通过寻找靶向昆虫胰蛋白酶的miRNA可以为农业昆虫的防治提供更多选择。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种靶向Trypsin-9基因的miR-283-3p。

本发明的第二个目的在于提供一种提高miR-283-3p表达的miRNA模拟物。

本发明的第三个目的在于抑制所述miR-283-3p表达的miRNA抑制剂。