[发明专利]基于酪氨酸酶催化的革兰氏阳性菌表面修饰方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于酪氨酸酶催化的革兰氏阳性菌表面修饰方法及其应用。该修饰方法使用酪氨酸酶及带有苯酚基团的修饰分子。这种修饰方法能够直接对革兰氏阳性菌细胞壁进行化学修饰，并实现革兰氏阳性菌特异性的荧光成像、光动力抗菌、磁珠分选及肉眼可视化检测。相比传统的细菌修饰方法，本发明公开的修饰方法具有成本低、修饰效率高和操作简单等优点。

技术领域

本发明涉及一种基于酪氨酸酶催化的革兰氏阳性菌表面修饰方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，越来越多的研究表明细菌对于人体健康是一把“双刃剑”。一方面，每年各种致病菌及耐药菌的传播会导致大量细菌感染病例的出现，对人类的正常生活构成了严重威胁；另一方面，人体内存在数以亿万计的共生细菌，尤其是肠道微生物群，它们在维持消化系统功能和参与调控全身免疫系统等诸多方面发挥着重要的作用。为了揭示细菌的各种生物学特性，对细菌进行荧光标记是一项基本的研究手段。目前，荧光蛋白标记技术是一种普遍采用的策略，它通过对目标细菌转染经过工程化改造的质粒，使细菌在特定的位点表达荧光蛋白，从而方便研究者进行原位示踪。然而，该策略操作复杂，成本高，并且不适用于厌氧菌以及那些无法在实验室内培养的菌种。最近，基于D型氨基酸的细菌代谢标记技术得到了广泛的关注。该技术首先给细菌孵育标记有荧光基团的D型丙氨酸衍生物，然后利用细菌自身合成的代谢途径将修饰分子引入到细胞壁的肽聚糖结构中，进而实现对细菌的特异性荧光标记。此外，通过将荧光基团替换为生物正交反应基团，该技术还能够实现对细菌表面的官能团化，为后续的化学修饰提供了反应位点。不过，这种基于细胞代谢的修饰策略无法对死细菌或细菌碎片进行标记，并且其修饰效率严重依赖于细菌的生长状态或活性。因此，继续发展新型的细菌标记技术具有极为重要的研究意义。

发明内容

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种无需质粒转染或细胞代谢参与，能够直接对细菌表面进行高效化学修饰的方法。

技术方案：为了实现上述目的，本发明公开一种针对革兰氏阳性菌的化学修饰方法。

本发明所述的一种基于酪氨酸酶催化的革兰氏阳性菌表面修饰方法，所述方法使用酪氨酸酶和含苯酚基团的修饰分子。

优选的，所述酪氨酸酶为来源于菌菇的多酚氧化酶。

优选的，所述含苯酚基团的修饰分子包括生物素基酪酰胺、Cy3-酪酰胺、Cy5-酪酰胺和Cy7-酪酰胺。

进一步的，所述修饰方法包括以下步骤：

(1)取革兰氏阳性菌菌液，离心得细菌沉淀，清洗后重悬于生理盐水中；

(2)将酪氨酸酶和含苯酚基团的修饰分子加入到步骤(1)的细菌悬液中，反应后清洗得到经修饰的革兰氏阳性菌。

步骤(2)中，所述反应是指在室温下震荡反应10～15分钟。所述酪氨酸酶和含苯酚基团的修饰分子在细菌悬液中的终浓度范围分别为10-500μg/mL和0.1-100μg/mL。

步骤(1)和步骤(2)中，所述清洗是指用生理盐水清洗细菌2～3次。

进一步的，本发明还提供了所述修饰方法在针对革兰氏阳性菌的荧光成像(革兰氏阴、阳性菌的区分)、光动力抗菌、磁珠分选以及肉眼可视化检测方面的应用。

本发明所述的修饰方法中包括酪氨酸酶和带有苯酚基团的修饰分子。该方法利用酪氨酸酶的催化特性，将修饰分子中的苯酚基团氧化为具有高度反应活性的邻苯醌式结构。邻苯醌能够与革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖结构发生共价反应，从而将荧光基团或生物素基团引入到细菌表面。相比之下，革兰氏阴性菌的细胞壁由一层外膜包覆，阻碍了修饰分子与肽聚糖的结合，因此不能被该方法修饰。