[发明专利]一种基于特异性适配体的密封纸基铅离子传感器

权利要求书

1.一种基于特异性适配体的密封纸基铅离子传感器，其特征是包括以下制备步骤：

(1) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计一个多区域多次疏水蜡打印图案，并利用喷蜡打印机将第一层图案批量打印到裁剪为A4尺寸的纸上，随后将其在加热板上加热至蜡融化并渗透至纸的背面，形成多维度疏水结构，借助折纸技术构筑纸基传感器；该密封纸基传感器包括四个蜡打印疏水区域分别是：区域A为保护区域，区域B为检测区域，区域C为电极区域，区域D为入口通道，各区域间预留有狭长空白区域以供折叠，其中入口通道区域被疏水蜡包围防止液体外渗，入口通道与电极区域联用辅助液体流动进入，同时入口通道可避免三电极体系直接接触发生短路，保护区域防止密封步骤破坏检测区域；

(2) 步骤(1)所述的多区域疏水蜡打印传感器图案的总宽度为65-80 mm，总长度为75-95 mm，每张A4尺寸的纸打印至多8个纸基传感器图案；其中保护区域宽度为20-25 mm长度为8-13 mm；检测区域宽度为20-25 mm长度为35-40 mm，检测区域包括亲水圆形部分直径为5-7 mm，及亲水矩形部分宽度为4-6 mm长度为15-20 mm；电极区域宽度为35-40 mm长度为30-40 mm，包括单层疏水矩形部分宽度为3-6 mm长度为14-18 mm，及亲水圆形部分直径为6-8 mm；入口通道区域宽度为30-35 mm长度为30-40 mm，包括矩形部分宽度为3-6 mm长度为14-18 mm，及圆形部分直径为6-8 mm；

(3) 在区域B进行原位生长金纳米颗粒具体步骤为：首先将80 mL超纯水加热至90 ℃，加入0.8 mL质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96 ℃保持1分钟，最后加入2.8 mL质量分数为1%的柠檬酸钠，加热15分钟，得到纳米金溶液，取100 μL纳米金溶液滴加在检测区域亲水区，静置晾干，重复两次后将体积比为1：1的200 mM盐酸羟胺和质量分数为1%的氯金酸溶液混合均匀，取150 μL混合溶液滴加到已修饰的检测区域，静置反应30分钟，用超纯水冲洗3次，得到金纳米颗粒修饰的检测区域，自然干燥后在检测区域背面重复该步骤生长金纳米颗粒；

(4) 在区域B二次打印蜡进行分区，通过丝网印刷在区域D印刷参比电极和对电极，并抛光打磨，具体步骤为：利用喷蜡打印机将已设计好的第二层蜡图案打印到修饰后的检测区域，该矩形四分色参数为C 100%、M 100%、Y 100%、K 100%，将检测区域分为导电区及工作区，第二层蜡图案为矩形，宽度为15 mm长度为4 mm，使检测区域已生长金纳米颗粒部分被分为矩形导电区及圆形工作区；将氯化银参比电极和碳对电极丝网印刷到电极区域，静置晾干后，使用玛瑙研钵同方向多次打磨参比电极及对电极；

(5) 配制适配体Probe 1、Probe 2溶液，具体步骤为：将Probe 1、Probe 2在转速4000转/秒条件下离心60秒；在Probe 1中加入30 μL 10 mM的pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，配制100 μM的Probe 1准备溶液，在Probe 2中加入43 μL 0.5 M的pH为5.2的醋酸钠缓冲溶液，配制100 μM的Probe 2准备溶液；取3 μL 100 μM的Probe 1准备溶液加入500 μL 10 mM的pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、500 μL 1 mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，配制0.3 μM Probe 1溶液；将1 mL 0.5 M pH为5.2的醋酸钠缓冲溶液、1.5 μL 10 mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到10 μL 100 μM的Probe 2准备溶液中，配制0.4 μM Probe 2溶液，以上Probe 1溶液、Probe 2溶液室温避光反应1小时后，在-20℃的冰箱内保存备用；

(6) 在工作区功能化修饰Probe 1，具体步骤为：将10 μL的Probe 1溶液滴加于金纳米颗粒修饰的检测区域圆形部分表面，于37 ℃条件下孵育12小时，用100 μL 10 mM的pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗去未与电极表面相连的Probe 1，重复三遍，自然干燥后用10 μL 1 mM的6-巯基-1-己醇封闭电极表面未结合核酸链的活性位点，用100 μL10 mM的pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗去过量的6-巯基-1-己醇并晾干，重复三遍；

(7) 制备杨梅状纳米铂，具体步骤为：准确称取0.0415 g氯亚铂酸钾溶解到5 mL超纯水中，于4 ℃的冰箱内保存24小时，得到20 mM的氯亚铂酸钾溶液，向其中加入0.0500 g普兰尼克F-127超声溶解，继续快速加入5 mL新配制的0.1 M的L-抗坏血酸溶液，在500 W的数控超声波清洗器的80%功率条件下，超声反应10分钟，溶液颜色由透明的浅棕黄色变为棕色，最后变为不透明的黑色，在10000转/秒转速下离心20分钟后去除上清液，加入适量超纯水在10000转/秒转速下离心20分钟进行清洗，重复4次，在50 ℃环境下干燥96小时后得到杨梅状纳米铂；

(8) 制备Probe 2/杨梅状纳米铂复合物，通过碱基互补配对固定于工作区，具体步骤为：向2.5 mL 0.4 μM的Probe 2溶液中加入30 mg制备的杨梅状纳米铂，室温搅拌16小时后，继续加入500 μL 100 mM的氯化钠溶液、500 μL 10 mM的pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，室温避光反应24小时，将该溶液在8000转/秒转速下离心10分钟后，去除上清液，加入500 μL 300 mM的氯化钠溶液、10 mM pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，得到Probe 2/杨梅状纳米铂复合物；将20 μL Probe 2/杨梅状纳米铂复合物滴加于电极表面，37 ℃条件下孵化2小时，使Probe 1与Probe 2充分反应，用100 μL 10 mM pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗去未与Probe 1结合的Probe 2/杨梅状纳米铂复合物，重复三次；

(9) 取20 μL含有铅离子的待测溶液滴加于工作区，37 ℃条件下孵化2小时后，用10mM pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液重复三次冲洗，去除脱落的Probe 2/杨梅状纳米铂复合物；

(10) 沿入口通道和检测区域二者之间的狭长空白区域折叠一次，随后沿保护区域和检测区域二者之间的狭长空白区域对折一次；折叠后形成的纸基传感器自上而下分别是保护区域、检测区域、入口通道及电极区域；将折叠后的纸基传感器放置在塑封膜之间加热密封，随后将此纸基电致化学发光传感器件连接到电化学工作站，注入用10 mM pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液配制的已除氧20分钟的0.1 M过硫酸钾溶液，精准检测铅离子浓度；

(11) 绘制电致化学发光强度与铅离子浓度的标准曲线，完成样品液的铅离子检测。