[发明专利]肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E‑Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法。试剂盒包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E‑Cadherin组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肾细胞癌患者E‑Cadherin表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率约占全身恶性肿瘤的2-3％，近几十年其发病呈上升趋势。根治性手术是治疗肾细胞癌的有效手段，但约有20％～30％的肾细胞癌患者就诊时已出现远处转移。即使经历肾细胞癌根治手术，仍有20％～40％的患者会出现复发、转移。既往研究认为，上皮间质转化（EMT）在肾细胞癌复发转移过程中发挥了重要作用，因此监测EMT可用于肾细胞癌的疗效判断及预后评估。

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。

E-钙粘蛋白(E—Cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，E-Cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此E-Cadherin检测被作为鉴定肾细胞癌EMT发生的主要手段之一。大量研究证实，不同的肿瘤的进展都与EMT的发生有关，且都伴随着E-Cadherin表达的改变。而目前临床实践中，肾细胞癌患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)E-Cadherin表达情况对肾细胞癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。

发明内容

为了克服晚期或复发肾细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者E-Cadherin状态的不足，本发明提供了一种肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发非肾细胞癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫荧光技术检测CTC的E-Cadherin表达情况。

本发明采用的技术方案如下：（权利要求书）

一种检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的试剂盒，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；

一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；