[发明专利]具有立体选择性的酮还原酶与(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法

权利要求书

1.一种具有立体选择性的酮还原酶，其特征在于，所述具有立体选择性的酮还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，包括：

作为反应底物乙酰乙酸乙酯在具有立体选择性的酮还原酶的催化下生成目标产物(S)-3-羟基丁酸乙酯，其中，所述具有立体选择性的酮还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：向反应容器中一并加入乙酰乙酸乙酯，异丙醇，包含所述具有立体选择性的酮还原酶的重组大肠杆菌酶液，辅酶NAD以及缓冲液；加热，并搅拌反应；

S2：反应完全后，后处理，即得目标产物(S)-3-羟基丁酸乙酯。

4.根据权利要求3所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，所述乙酰乙酸乙酯占反应体系总体积的体积浓度为10～46％，所述重组大肠杆菌酶液占反应体系总体积的体积浓度为10～15％。

5.根据权利要求3所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌酶液的制备方法包括以下步骤：

P1：将表达所述具有立体选择性的酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体与缓冲液混合；

P2：在800bar的压力下进行均质破碎，得到酶液粗品；

P3：离心，取上清液，即得所述重组大肠杆菌酶液。

6.根据权利要求5所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液。

7.根据权利要求6所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.1M，且所述PBS缓冲液的pH＝7.5。

8.根据权利要求5所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，在步骤P1中，所述重组大肠杆菌湿菌体与所述缓冲液的混合比例为1g：6mL。

9.根据权利要求5所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌湿菌体的制备步骤包括：

P11：将所述具有立体选择性的酮还原酶的核苷酸序列连接至表达载体质粒，电转化至大肠杆菌感受态细胞，孵育1h，涂LB培养基，37℃培养箱过夜培养；接着，取1.5mL EP管，加入1mL TB培养基，挑单克隆于TB培养基，37℃，摇床培养；然后，加入15％甘油，混匀，-80℃保菌备用，即得重组大肠杆菌BL21菌株；

P12：将所述重组大肠杆菌BL21菌株接种至含氯霉素的LB培养基，置于30℃，摇床振荡培养过夜；当培养液的OD 600达到2时，按5％(v/v)的接种量接入TB培养基，置于30℃，摇床振摇培养；当培养液的OD 600达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG作为诱导剂，30℃诱导20h后，将培养液离心，弃上清液，收集细胞，即得所述重组大肠杆菌湿菌体。

10.根据权利要求9所述的(S)-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成方法，其特征在于，在步骤P11中，所述LB培养基中氯霉素的浓度为50μg/mL，且所述TB培养基中氯霉素的浓度为50μg/mL；在步骤P12中，所述LB培养基中氯霉素的浓度为30μg/mL。