[发明专利]一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法在审
| 申请号： | 202010620559.X | 申请日： | 2020-07-01 |
| 公开（公告）号： | CN111830256A | 公开（公告）日： | 2020-10-27 |
| 发明（设计）人： | 池喜峰;来丽丽;王宇;赵成成 | 申请（专利权）人： | 北京基谱生物科技有限公司 |
| 主分类号： | G01N33/58 | 分类号： | G01N33/58;G01N33/53;G01N1/30;G01N1/31 |
| 代理公司： | 广州高炬知识产权代理有限公司 44376 | 代理人： | 高雁 |
| 地址： | 102205 北京市*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 石蜡 切片 免疫 荧光 多重 染色 试剂盒 使用方法 | ||
1.一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒，包括试剂A、试剂B、稀释液、FITC试剂、Cy3试剂及Cy5试剂；
所述试剂A主要为Biotin-Tyramide；
所述试剂B为30％H2O2；
所述稀释液为pH为7.4的磷酸缓冲液；
所述FITC试剂为Streptavidin-FITC；
所述Cy3试剂为Streptavidin-Cy3；
所述Cy5试剂为Streptavidin-Cy5。
2.一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：试剂准备，包括以下步骤：
S1-1：取1ul试剂A溶于500ul稀释液，做为试剂1；
S1-2：取1ul试剂B溶于10ul稀释液，做为试剂2；
S1-3：取1ul上述试剂2溶于100ul上述试剂1，制得多重IF染色工作液；
S1-4：取1ul FITC试剂溶于1ml稀释液，制得FITC工作液；
S1-5：取1ul Cy3试剂溶于1ml稀释液，制得Cy3工作液；
S1-6：取1ul Cy5试剂溶于1ml稀释液，制得Cy5工作液；
S2：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、85％酒精5min及75％酒精5min，最后蒸馏水洗；
S3：抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于蒸锅内进行抗原修复，温度达到95℃后计时30min，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S4：画圈自发荧光淬灭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止抗体流走，在圈内加入自发荧光淬灭剂A，室温孵育15min，然后流水冲洗10min，在圈内加入自发荧光淬灭剂B，室温孵育10min，然后流水冲洗10min；
S5：血清封闭:在圈内滴加5％BSA室温孵育30min；
S6：加第一种一抗：甩掉封闭液，圈内滴加第一种一抗，湿盒内4℃孵育过夜；
S7：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内孵育1h；
S8：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S9：加FITC工作液：切片稍甩干后在圈内滴加FITC工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S10：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S11：加第二种一抗：在切片上滴加稀释后的第二种一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜；
S12：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S13：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S14：加Cy3工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy3工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S15：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S16：加第三种一抗：在切片上滴加稀释后的第三种一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜；
S17：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S18：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S19：加Cy5工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy5工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S20：DAPI复染细胞核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
S21：封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；
S22：镜检：显微镜下选取视野拍照。
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