[发明专利]一种经基因修饰的CD96蛋白及其单克隆抗体和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经基因修饰的CD96蛋白及其单克隆抗体和应用。本发明利用FAT10对CD96进行了修饰，得到优化后的FAT10‑CD96蛋白，并利用此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明的抗CD96单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×10⁵以上。能够特异性的结合CD96蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，也可能对进一步开发以CD96为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种经基因修饰的CD96蛋白及其单克隆抗体和应用。

背景技术

急性髓细胞白血病（AML）是一类起源于造血干细胞（LSCs）的恶性增殖性疾病，具有发病快、病情凶险、控制难、易复发、预后差和发病率随着年龄的增加而上升等特征，形势严峻。目前用于AML的治疗方法主要为联合化疗和造血干细胞移植，具有明显的副作用，且不能有效改善患者的5年生存率或完全缓解率。近年来，随着对AML的不断研究，针对LSCs的细胞表面分子标志物的靶向治疗成为当前研究的热点。AML中LSCs的表型分析的研究显示约60% AML患者的LCSs细胞表面的CD96蛋白表达为阳性。在不同类型的AML中均存在CD96蛋白的阳性表达，并且与正常人造血干细胞（HSCs）相比，AML患者的LSCs中CD96的表达上调约10倍。CD96 蛋白的阳性表达被当作AML的一项肿瘤标志物，因此，如何高效高特异性的鉴定CD96的表达显得尤为重要，继续开发一种高特异性、高亲和性、高产量的CD96抗体，对AML-LSCs的诊断及以CD96为靶点的特异性免疫治疗药物等方面具有重要的意义。

类泛素蛋白是一类与泛素有类似空间结构及酶修饰系统的蛋白质，它们在核质转运、转录调节、稳定蛋白质、应激反应以及细胞周期调控等多种生物学功能中发挥着重要作用，并且在抗肿瘤药物的研究中也发现，通过调控类泛素化修饰可以改变药物的抗肿瘤作用，是肿瘤防治药物的新的靶点。人类白细胞抗原（FAT10）是一种类泛素蛋白，参与肿瘤的发生发展过程。其在多种癌症中存在高表达现象，在免疫代谢调节中发挥一定的作用。目前还没有CD96蛋白修饰相关抗体的研究报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种经基因修饰的CD96蛋白及其单克隆抗体和应用。本发明利用分子生物学技术设计一种经FAT10修饰的CD96融合表达蛋白，开发出一种高特异性、高亲和性、高产量的CD96抗体，对进一步以CD96为靶点的特异性免疫治疗药物等方面具有重要的意义。

本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：

一种经FAT10修饰的CD96蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

一种经FAT10修饰的CD96蛋白，由上述经FAT10修饰的CD96蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

一种表达载体，该载体含有上述经FAT10修饰的CD96蛋白基因。

在某一具体实施方案中，本发明还提供有一种抗CD96单克隆抗体，所述抗CD96单克隆抗体采用上述经FAT10修饰CD96蛋白基因的表达载体为免疫原；所述的抗CD96单克隆抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO. 4所示。

在某一具体实施方式中，本发明还提供所述抗CD96单克隆抗体的一种制备方法，首先用FAT10-CD96重组蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗CD96单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗CD96单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗CD96单克隆抗体。具体制备工艺步骤如下：

（1）重组蛋白的表达与纯化；