[发明专利]一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体与应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体的制备和应用。本发明利用SUMO对VEGFA进行了修饰，得到优化后的SUMO‑VEGFA蛋白，并有利于此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明的抗VEGFA单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×10⁶以上。能够特异性的结合VEGFA蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，也可能对进一步开发以VEGFA为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体与应用。

背景技术

癌症血管生成是肿瘤生长的基本过程，这个过程会产生新的血管，给肿瘤细胞提供了增殖所需的氧气和营养的供应，促进了癌症的发展与转移，在癌症的病理过程中都发挥着重要的作用。血管生成过程复杂，有许多调控因子参与。其中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族及其受体（VEGFRs），是促进血管细胞分化和血管形成最重要的组织因子。VEGF家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盘生长因子（placental growth factor，PIGF）五个成员。VEGFA是一种45 KD 的同型二聚体糖蛋白，是该家族成员中最具特异性、功能性最强的血管生成因子，VEGFA主要与VEGFR2结合，参与血管生成的调控，是参与活化促进血管内皮细胞有丝分裂和通透性最主要的信号传导通路。VEGFA与VEGFR2结合前后会引发上下游通路中无数中间信号形成级联反应，最终以内皮细胞增殖、存活、迁移、通透性增加及浸润到周围组织等，促进肿瘤的生长和转移。

近年来，VEGFA被发现或可作为癌症早期检测和不良预后的肿瘤标志物，其在胃癌、肠癌等多种肿瘤中高表达。目前用于检测的VEGFA抗体存在特异性差，产量低等的缺点，限制了VEGFA的应用，因此，开发一种特异性好、亲和性高的SUMO化修饰的VEGFA抗体，可能对以VEGFA为靶点的临床诊断及生物治疗药物具有重要的临床意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种经SUMO修饰的VEGFA蛋白基因SUMO-VEGFA蛋白，利用该SUMO-VEGFA构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，获得的抗VEGFA单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于分子免疫学研究，或制成多种体外诊断试剂盒用于检测VEGFA抗原的免疫检测工具中。可用于制备抗VEGFA的生物诊断试剂的研究与开发。

本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：

一种经修饰的VEGFA蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

一种经修饰的VEGFA蛋白，由上述经修饰的VEGFA蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

一种表达载体，该载体含有上述经修饰的VEGFA蛋白基因。

在某一具体实施方案中，本发明还提供有一种抗VEGFA单克隆抗体，所述抗VEGFA单克隆抗体采用上述经修饰VEGFA蛋白基因的表达载体为免疫原；所述的抗VEGFA单克隆抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ .ID.NO. 3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ .ID.NO. 4所示。

在某一具体实施方式中，本发明还提供所述抗VEGFA单克隆抗体的一种制备方法，首先用SUMO-VEGFA蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗VEGFA单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗VEGFA单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗VEGFA单克隆抗体。具体制备工艺步骤如下：

（1）重组蛋白的表达与纯化；

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；