[发明专利]一种检测核酸聚合酶活性的检测方法

说明书

本发明公开了一种检测核酸聚合酶活性的检测方法。检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行延伸反应，之后对延伸产物的浓度进行qubit核酸浓度检测，基于检测结果分析核酸聚合酶的活性。该检测方法解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系，其能够直接以单链DNA作为模板，评估核酸聚合酶的延伸活性。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测核酸聚合酶活性的检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是常用的分子检测技术，PCR技术是以双链DNA作为模板，单链寡核苷酸为引物，通过热稳定的DNA聚合酶在一定反应环境内催化引物按碱基互补配对原则沿着模板链延伸。经过热变性、退火、延伸三个步骤的重复循环，实现在体外将特定的核苷酸片段进行指数级扩增的目的。

PCR发生循环反应时对不同的循环步骤有不同的温度，要求的温度分别为变性(90℃左右)、退火(50℃左右)、延伸(70℃左右)。Taq DNA聚合酶在90℃以上仍能保持一定活性，因而是PCR反应常用的聚合酶。

TaqDNA聚合酶的最高生物学活性温度在70℃～75℃，然而PCR反应在升温时(20℃～70℃)，TaqDNA聚合酶仍然有一定的聚合酶活性，如果没有进行热启动封闭，那么聚合酶就可能在该环境下进行催化延伸，容易使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性。因此如何在初始循环的热变性前将TaqDNA聚合酶及高保真聚合酶的延伸活性进行抑制成为了现今的研究热点。研究发现可以通过对酶进行化学修饰、物理隔绝法、抗原抗体法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行结构改造来将TaqDNA聚合酶在未达到最适反应温度前的酶延伸活性进行抑制，实现热启动的目的。

目前检测聚合酶的延伸活性的抑制效果常用的手段是通过设计某些特定的容易出现非特异扩增的引物，以某些复杂的双链DNA为模板，进行PCR反应(变性、复性、延伸)，最后通过产物电泳的方法，观察电泳条带的结果(非特异条带、引物二聚体)是否存在或量的多少来判断非特异扩增结果，进而推测在初始变性前(20℃～70℃)聚合酶的延伸活性是否被抑制。上述检测方法操作繁杂，不能快速完成检测。

针对上述问题，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测核酸聚合酶活性的检测方法，该检测方法解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系，其能够直接以单链DNA作为模板，评估核酸聚合酶的延伸活性。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测核酸聚合酶活性的检测方法,检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行延伸反应，之后对延伸产物的浓度进行qubit核酸浓度检测，基于检测结果分析核酸聚合酶的活性。

优选的，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，对应单链DNA设计的引物序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述单链DNA的结构为：

优选的，所述检测核酸聚合酶活性的检测方法所针对的核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶。

优选的，单链DNA、对应单链DNA设计的引物、10×PCR buffer、H₂O和dNTP组成初步反应体系，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物的结合在初步反应体系中完成。

优选的，所述初步反应体系的反应条件为95℃反应3min后自然冷却。