[发明专利]一种经基因修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种经基因修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用。本发明利用NEDD8对CD47进行了修饰，得到优化后的NEDD8‑CD47蛋白，并利用此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明的抗CD47单克隆抗体具有特异性高、可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×10⁵以上。能够特异性的结合CD47蛋白可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，对进一步开发以CD47为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种经基因修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用。

背景技术

分化簇47（CD47）是一种广泛表达的细胞膜表面的免疫球蛋白，又称整合素相关蛋白。CD47通过与巨噬细胞表面的胞外配体SIRPα结合，从而传导抑制性信号降低巨噬细胞的吞噬活性，进而对固有免疫系统产生抑制作用。CD47分子与多种恶性肿瘤密切相关，在大部分肿瘤细胞中呈现高表达。肿瘤细胞凭借这种信号逃避了机体对肿瘤细胞的杀伤作用，从而产生了免疫逃逸现象，促进肿瘤的发展。因此肿瘤组织中的CD47的蛋白表达及CD47抗体的靶向免疫治疗成为研究热点。目前多项研究表明， CD47单克隆抗体已在多种实体肿瘤治疗的相关研究中获得显著的效果，CD47单克隆抗体在肿瘤的靶向治疗中显示了强大的疗效。因此，开发一种高效的高特异性的抗CD47抗体显得尤为必要。目前还未见有对CD47蛋白进行修饰的相关研究报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种经修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用。本发明利用分子生物学技术设计一种经NEDD8修饰的CD47融合表达蛋白，开发出一种高特异性、高亲和性、高产量的CD47抗体，对进一步以CD47为靶点的特异性免疫治疗药物等方面具有重要的意义。

本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：

一种经NEDD8修饰的CD47蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

一种经NEDD8修饰的CD47蛋白，由上述经NEDD8修饰的CD47蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

一种表达载体，该载体含有上述经NEDD8修饰的CD47蛋白基因。

在某一具体实施方案中，本发明还提供有一种抗CD47单克隆抗体，所述抗CD47单克隆抗体采用上述经NEDD8修饰CD47蛋白基因的表达载体为免疫原；所述的抗CD47单克隆抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在某一具体实施方式中，本发明还提供所述的抗CD47单克隆抗体的一种制备方法，首先用NEDD8-CD47重组蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗CD47单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗CD47单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗CD47单克隆抗体。具体制备工艺步骤如下：

（1）重组蛋白的表达与纯化；

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选；

（4）抗CD47单克隆抗体的生产及纯化。

在某一具体实施方式中，本发明还提供了一种能产生上述抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明还提供了所述抗的CD47单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。

进一步地，所述的抗CD47单克隆抗体在制备检测CD47蛋白的生物检测试剂中的用途。进一步的所述的用途为制备检测CD47抗原的试剂，具体的为检测细胞中的CD47蛋白。