[发明专利]一种通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者E-Cadherin表达的方法

说明书

一种检测结直肠癌患者外周血循环的E‑Cadherin蛋白表达的方法，具体的，通过试剂盒（稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、兔抗人E‑cad抗体、山羊抗兔IgG/HRP 100μL、0.1%Triton X‑100 100μL、0.3%H₂O₂100μL、试剂A、试剂B、6×PBS缓冲液60mL）。通过采集外周血，预处理外周血，富集外周血中的CTC，染色，最后使用免疫组化技术检测基因的表达情况，从而确定患者的癌症时期和复发情况。

技术领域

本发明涉及一种检测E-Cadherin表达的新方法，尤其是通过外周血检测无法获取组织标本的晚期或复发结直肠癌患者E-Cadherin表达的方法。

背景技术

结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，2018年死亡率居恶性肿瘤第四位。在美国，结直肠癌是第三大最常见的恶性肿瘤。在国内，2018年中国全年流行病学数据：结直肠癌的发病率和死亡率均为第5位，年新发病例37.63万，25％被确诊时已发生转移。结直肠癌早期多无症状，出现症状时多为中晚期且有转移。尽管外科手术和化疗方案不断革新，进展期结直肠癌患者的生存率依旧很差。由于结直肠癌尚缺乏较好的预防方法，所以改善结直肠癌预后并提高生存率的最有效的措施就是早期诊断并治疗结直肠早期癌及癌前病变。

E-钙粘蛋白(E—Cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，E-Cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此E-Cadherin被当做鉴定结直肠癌EMT发生的主要手段之一，作为一类细胞表面糖蛋白，E-Cadherein在细胞-细胞之间的粘附中发挥重要作用，并参与组织器官形态的维持。近年来有关于结直肠癌EMT和肿瘤耐药之间的关系日益受到重视，大量研究显示在不同的肿瘤当中由于EMT的发生而同时耐药性的升高，并且都伴随着E-Cadherin表达的改变。目前临床实践中，结直肠癌患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。

目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA 125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。

发明内容

针对现有技术中存在问题，本发明提供了一种通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者E-Cadherin蛋白表达的方法非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的术后结直肠癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的E-Cadherin表达情况。

本发明采用的技术方案如下：