[发明专利]一种羟基马桑内酯半抗原及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种羟基马桑内酯半抗原及其制备方法与应用。羟基马桑内酯半抗原，具有如下结构：。利用本发明提供的羟基马桑内酯半抗原与载体蛋白的偶联物，通过免疫小鼠可以获得抗羟基马桑内酯的抗体，且制备过程简单、经济，抗体效价最高可达135000，检测灵敏度为7.7 ng/mL，实用价值高，在公共卫生安全检测中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种羟基马桑内酯半抗原及其制备方法与应用。

背景技术

马桑(Coriaria Sinica Maxim)是桑科马桑属的一种有毒植物，又名醉鱼草。马桑植中含有丰富的倍半萜酯类有毒物质，如马桑内酯、羟基马桑内酯、马桑宁和马桑亭等，因此，马桑全株有毒，尤其是未成熟的果实毒性最大。由马桑引起的中毒事件屡见不鲜，主要是儿童误食马桑果。马桑中毒患者初期表现为恶心、呕吐、头晕、头痛等症状，严重中毒者会出现频繁的抽搐、持续癫痫、昏迷等症状。若中毒严重患者得不到及时有效地医学救治，会因呼吸衰竭而致人死亡。此外，当周围蜜源匮乏时候，蜜蜂会采集寄生在马桑表面的蚜虫的排泄物酿制蜂蜜，该采蜜途径会将马桑中的毒素迁移、并富集在蜂蜜中，形成有毒蜂蜜，人一旦食用这样蜂蜜，便会爆发蜂蜜中毒事件。当前中毒患者的确诊主要是通过询问患者的是否食用马桑果、草药和蜂蜜等进行初步判断，然后采用液相色谱或者液相串联质谱等分析其胃内容物中的马桑毒素的含量进行确诊。由于仪器分析的方法往往需要繁琐的样本前处理和专业检测人员的操作，且耗时较长，因此难以满足临床医生快速做出判断的需要。如何快速、准确的识别和鉴定马桑毒素成为当前临床医学和食品安全领域急需解决的问题之一。

虽然马桑中的植物毒素种类繁多，高达几十种，但是羟基马桑内酯和马桑内酯的含量较高，且两者的毒性最大(两者在小鼠中LD₅₀均小于 3 mg/kg.B.W)，故两者是导致马桑中毒的关键植物毒素。检测中毒患者胃内容物中两种植物毒素的含量已经成为当前临床医生进行中毒原因的确证的主要方式。如何开发适用于现场诊断马桑中毒的方法依然匮乏。基于免疫分析开发的小分子检测方法具有高灵敏度、高准确度、检测速度快、成本低、操作简单等优点，目前已经报道了众多基于免疫分析的植物毒素快速检测方法，但是有关羟基马桑内酯和马桑内酯的免疫检测分析尚未见报道。在小分子免疫分析方法开发中，获得高灵敏度和特异性的抗体最为关键，而半抗原的设计与改造是获得高质量抗体的核心。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明首次提供了基于羟基马桑内酯改造的半抗原，用于免疫动物获得特异性抗体，并为后期开发羟基马桑内酯与马桑内酯的检测方法，从而为马桑中毒的临床诊断提供数据和技术支撑。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供羟基马桑内酯半抗原，具有如下结构：

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本发明的第二目的在于提供所述的羟基马桑内酯半抗原的制备方法，将羟基马桑内酯与琥珀酸酐在55~65℃（更优选为60℃）下反应，得到所述羟基马桑内酯半抗原。

本发明发现，在上述条件下，可以在羟基马桑内酯的特定羟基位点引入间隔臂琥珀酸酐，获得本发明所述的羟基马桑内酯半抗原。

在此基础上，本发明进一步对制备方法进行了优化，得到如下方案：

在一些优选方案中，所述反应在在吡啶中进行；优选所述的吡啶为无水吡啶。

在一些优选方案中，所述羟基马桑内酯与所述琥珀酸酐的摩尔比为1:0.8~1.2，更优选为1:1。

在一些优选方案中，所述反应在避光条件下进行。

在一些优选方案中，所述反应在油浴条件下反应7~9 h，更优选为8 h。

作为优选，在所述反应后，还包括纯化过程，所述纯化过程具体为：用乙酸乙酯萃取反应产物后，用稀盐酸洗涤有机相，在有机相干燥浓缩后，经C18色谱柱分离纯化，即可获得羟基马桑内酯半抗原。