[发明专利]检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及方法

说明书

本发明公开了种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞E‑Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，试剂盒包括稀释液，脱色液，染色液A，染色液B，甲醇、2%PFA，10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E‑Cadherin组成的一抗混悬液，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液，DAPI封片剂；检测方法包括外周血采集，膜过滤分离，染色，判断是否存在CTC，并通过免疫荧光方法检测外周血CTC的E‑Cadherin表达情况。本专利提供的方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发前列腺癌患者E‑Cadherin表达情况，利用微创技术，能够实现实时动态检测。

技术领域

本发明提供了一种前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

在世界范围内，前列腺癌发病率居男性恶性肿瘤第2位，癌症特异性死亡居第6位。2015中国肿瘤登记年报显示，2011年中国前列腺癌发病率居恶性肿瘤第9位，城市男性前列腺癌的发病率和死亡率在男性恶性肿瘤中分别居第6位和第9位。前列腺癌治疗的难点是转移性前列腺癌，尤其是内分泌治疗后出现的去势抵抗现象，目前转移性前列腺癌去势抵抗后的治疗手段有限，并且会出现所有的常规治疗手段（放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗）都失效的情况。

随着分子生物学的发展，中晚期前列腺细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展，E-钙粘蛋白(E—Cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，E-Cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此E-Cadherin被当做鉴定前列腺癌E-Cadherin发生的主要手段之一，作为一类细胞表面糖蛋白，E-Cadherein在细胞-细胞之间的粘附中发挥重要作用，并参与组织器官的维持。近年来有关于前列腺癌E-Cadherin和肿瘤耐药之间的关系日益受到重视，大量研究显示在不同的肿瘤当中由于EMT的发生而同时耐药性的升高，并且都伴随着E-Cadherin表达的改变。目前，国内外前列腺癌诊治指南均认为：前列腺癌E-Cadherin突变检测的时间点包括初诊时及争取在疾病进展时再次检测，应通过重复检测减少假阳性和假阴性。

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。

针对目前临床实践中，前列腺癌患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)E-Cadherin表达情况对前列腺癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。