[发明专利]通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法

权利要求书

1.一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，与育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因构建含有四元转基因元件的四元连锁表达载体；

(2)将所述步骤(1)得到的四元连锁表达载体转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中，获得对对应类型除草剂敏感的繁殖系；

(3)使所述步骤(2)得到的繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有所述四元转基因元件的繁殖系和不含所述四元转基因元件的不育系，经过色选机筛选，将发荧光的繁殖系种子与不发荧光的不育系种子分开；

(4)采用对应类型除草剂对所述步骤(3)色选机筛选后的不育系种子进行除杂，去除色选漏检的含有所述四元转基因元件的繁殖系种子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物除草剂抗性基因为水稻OsHIS1基因，其对应类型除草剂为β三酮类除草剂，所述β-三酮类除草剂包括磺草酮、硝磺草酮、双环磺草酮、环磺酮和呋喃磺草酮中的任意一种或几种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述抑制植物除草剂抗性基因表达的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述RNAi沉默元件由植物除草剂抗性基因的CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列通过酶切连接反应一起连入RNAi沉默载体pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互补序列如SEQ ID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，若所述不育系为雄性不育系，所述育性恢复基因包括EAT1、PTC1、TDR或CYP704B2；若所述不育系为雌性不育系，所述育性恢复基因为PTB1。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因元件包括如SEQ ID NO.7所示的Pg47启动子序列、如SEQ ID NO.1所示的ZMAA1基因cDNA序列和如SEQID NO.8所示的IN2-1终止子序列。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光标记基因元件包括如SEQ ID NO.9所示的1tp启动子序列、如SEQ ID NO.2所示的DsRed基因cDNA序列和如SEQ IDNO.10所示的PINII终止子序列。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述四元连锁表达载体通过农杆菌介导转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中。

10.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用对应类型除草剂对色选机筛选得到的不育系种子进行去除的方式具体包括：采用对应类型除草剂对所述不育系种子进行包衣、在所述不育系种子浸种催芽过程中添加对应类型除草剂或在所述不育系种子播种、种植后进行田间喷施对应类型除草剂。