[发明专利]一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，包括引物设计、目的基因和蛋白标签片段的扩增、表达载体双酶切及重组酶处理、转化、阳性转化子检测及测序比对。本发明在目的基因和蛋白标签的序列片段上，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中F1与R2要分别和表达载体插入位置要有至少15bp的同源臂，R1与F2之间也要有至少15bp的同源臂。目的基因片段、蛋白标签和载体片段在重组酶反应后，利用大肠杆菌转化体系就可以得到同时含有目的基因和添加蛋白标签的环状质粒，该方法适用于构建各种多标签表达载体，具有简单、快速和高效等特点。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法。

背景技术

蛋白标签(protein tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种蛋白或多肽，主要用于目的蛋白的表达、纯化、检测和示踪等。随着功能基因组学和蛋白质组学的快速发展，越来越多的蛋白标签系统不断被发现，这也极大地丰富了蛋白标签的功能。根据试验的不同目的可以选择不同功能的蛋白标签，常用的蛋白标签有Flag、Myc、6×His、HA、GST和GFP/YFP/mCherry等。根据蛋白标签分子量的大小被分成两大类：大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段。前者主要有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)和GFP(绿色荧光蛋白)等，它们在使用过程中会增加目的蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中必须去除标签；后者主要有Flag(用于蛋白纯化和检测设计的多肽)、Myc(来源于人c-myc基因的表位标签)、6×His(六聚组氨酸)和HA(流感病毒血凝素表位)等，多数情况下多肽标签分子量相对较小，对融合蛋白的结构影响较小，不需要从融合蛋白中切除，所以多肽标签更为常用[1]。

不同的融合标签系统有其相同点，但各自也有其不同的优势和缺点。融合标签系统受到很多因素制约，例如融合标签系统的纯化条件、融合目的蛋白自身的性质(如等电点和细胞定位等)、纯化的基质及实验材料成本和融合标签的可去除性等[2]。综上所述，没有任何单一标签可以满足所有试验研究的需要。因而，开发两种甚至多种不同功能蛋白标签的组合使用，现已成为融合标签技术以后发展趋势。但传统的构建添加或替换目的基因的蛋白标签的方法存在试验环节较多，即需要多次构建并转化，测序验证目的基因和蛋白标签是否连接到表达载体上，操作繁杂且重复，往往还导致转化效率偏低等问题。针对这些问题，本研究基于重组酶反应，利用大肠杆菌转化体系可将一个蛋白标签与目的基因同时进行连接从而一步获得试验所需的重组表达载体，同时还可以一步添加多个蛋白标签或替换原有载体上的蛋白标签。该方法具有简单、快速和高效等特点，为进一步研究目的蛋白的功能提供了一定的技术基础。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的不足，提供一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的新方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明设计了一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，该方法包括如下步骤：

(1)引物设计：为目的基因和待添加或替换的新蛋白标签分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2之间要有15bp同源臂，F1和R2分别与被限制性内切酶双酶切之后的线性表达载体的两端要有15bp同源臂；

(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增：以含有目的基因的载体为模板，以F1、R1为引物对其进行PCR扩增；同样以含有待添加或替换的新蛋白标签的载体为模板，以F2、R2为引物对其进行PCR扩增，分别扩增出目的基因片段和待添加或替换的新蛋白标签片段；

(3)表达载体双酶切及重组酶处理：将表达载体用限制性内切酶双酶切得到线性表达载体，将步骤(2)获得的目的基因片段、待添加或替换的新蛋白标签片段和线性表达载体在重组酶反应体系下进行重组酶处理快速添加或替换目的基因的蛋白标签获得重组表达载体；