[发明专利]猪CD163蛋白单克隆抗体的制备方法、表位鉴定及应用

说明书

本发明涉及一株CD163蛋白单克隆抗体MAb的制备方法、表位鉴定以及应用。通过将CD163对于PRRSV复制具有重要作用的功能结构域SRCR5‑6克隆到pColdI载体中，构建出原核表达载体中携带His标签的CD163 SRCR5‑6的蛋白，纯化SRCR5‑6蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞同和制备杂交瘤细胞获得抗猪CD163蛋白的单克隆抗体，且对抗体进行了表位鉴定。

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体提供了一种猪源CD163单克隆抗体MAb的制备方法、表位鉴定及应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业的一个重要传染病，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒。PRRSV具有抗体依赖性增强作用，其抗原具有高度易变性，疫苗在保护同型PRRSV方面具有有效的作用，但对异型PRRSV的保护能力有限，深入开展PRRSV机制方面的研究将为我们更好地做好PRRSV的防控工作提供理论支持。

PRRSV具有严格的细胞嗜性，细胞表面受体在PRRSV感染的过程中具有重要的作用，当前已知的PRRSV受体有CD163、硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素、CD151、波形蛋白以及DC-SIGN。其中CD163为目前已知的主要的PRRSV受体，其参与病毒的脱衣壳过程，抗体封闭以及下调CD163能够抑制PRRSV复制。已有研究表明，缺失CD163 SRCR5的猪能够完全抵抗病毒的感染。进一步研究表明缺失CD163 SRCR5结构域的481-521位氨基酸能够完全抵抗PRRSV感染。另外，也有研究表明CD163的第561位氨基酸能影响PRRSV的复制，深入开展CD163机制方面的研究将为更好地做好PRRSV的防控工作提供理论支持。

CD163为富含半胱氨酸的清道夫受体，体外研究表明，多种细胞因子能够调节CD163的表达。糖皮质激素、IL-6、IL-10能够促进CD163表达，IL-1α、IL-1β，IL-8，IL-4、LPS、TNF-α、干扰素γ、CXCL4、Toll-like 受体2/4/5能够下调CD163的表达。激活的ADAM17能够促进CD163的脱落，减少细胞膜上CD163的表达。TREM2能够负调节促炎反应，增强CD163的表达，利于PRRSV感染。深入探究内源性CD163蛋白的表达情况与PRRSV复制间的关系，可为PRRSV防治提供新的靶点。

发明内容

当前，大多采用Bio-Rad公司生产的2A10/11 CD163单克隆抗体进行CD163的相关研究，该抗体可广泛地用于流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀中，但在western blot中需要进行特殊处理，该抗体只能检测非还原状态的CD163，对于较为珍贵的实验样品来说，较为不方便。

本发明所要解决的技术问题是，提供一株可用于检测还原状态下CD163蛋白的单克隆抗体，可应用于还原状态下CD163的western blot实验中。

为了解决上述问题，本法的技术方案是：通过将对PRRSV复制具有重要影响的CD163 SRCR5-6克隆到pColdI载体中构建出了原核表达载体，利用尿素梯度纯化的方式，将纯化后的CD163 SRCR5-6蛋白免疫Bal/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，用纯化的CD163 SRCR5-6蛋白包被板子，通过ELISA筛选能够特异性识别CD163的阳性杂交瘤细胞克隆。

具体发明有：获得了1株可特异性识别猪源CD163的单克隆抗体。可用于IFA、Western blot检测，能够很好地识别猪源CD163；亚型鉴定表明该单抗重链为IgG2a，轻链为Kappa链；通过构建不同截短表达的CD163表达质粒以及合成一系列CD163小肽，最终确定了该CD163单抗能特异性识别CD163蛋白497-506肽段，其氨基酸序列为5-⁴⁹⁷TWGTVCDSDF⁵⁰⁶-3，如SEQ ID NO.1所示。

附图说明