[发明专利]一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法

权利要求书

1.一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(A)GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和光引发剂溶于PBS中，在40-50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为5-15％的GelMA溶液；

(B)脱脂肪细胞外基质制备：将新鲜脂肪组织预处理后，20000-30000rpm捣碎处理5-10min，分别经0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA处理和3％Triton-X100处理1h后，经4％的脱氧胆酸钠和100％异丙醇分别处理1h和6h，即得；

(C)脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤(B)的脱脂肪细胞外基质制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4-10℃条件下搅拌48h后，低速离心10min，配制最终浓度为5-15mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；

(D)复合生物墨水配制：将步骤(A)制备的GelMA在适宜的温度下预热3-10min，在涡旋震荡速度1500-2500rpm的条件下，将步骤(C)中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为1-4:1，经过调节pH及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水；

步骤A所述的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或巴斯夫Irgacure2959，浓度为1-2％；

步骤(B)所述的新鲜组织来源于猪皮下脂肪或者人体腹部脂肪，组织预处理方法为-80℃和37℃冻融循环5次；

步骤(D)所述的适宜温度为40-50℃，调节pH为6.8-7.5。

2.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(C)所述的将脱脂肪细胞外基质制成细纤维状的方法为捣碎机30000rpm处理3-5min。

3.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤(C)所述的低速为3000-5000rpm。

4.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于所述pH调节方法为：将复合生物墨水置于冰上，边快速搅拌边逐滴滴加1M的NaOH溶液。

5.权利要求1所述仿细胞外基质可打印复合生物墨水的使用方法，其特征在于包括如下步骤：

将制备的仿细胞外基质可打印复合生物墨水与肿瘤细胞悬液配制成载细胞的复合生物墨水，无菌注射器中吸取后，将其装载在挤出式3D生物打印机，进行无菌打印；打印后的三维仿生载肿瘤细胞模型用405nm蓝光照射固化交联成型，无菌PBS清洗后放置于细胞培养基中，然后在37℃，5％CO₂培养箱中培养，经细胞生长、增殖、相关基因和蛋白表达后，最终形成类实体肿瘤微环境的体外肿瘤模型。