[发明专利]FimHEd

说明书

本发明涉及爱德华氏菌(Edwardsiella)的I型纤毛蛋白FimH(FimH_Ed)的应用，具体是FimH_Ed在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢传递载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用。本发明以FimH_Ed作为鱼类口服疫苗靶向肠道粘膜上皮细胞的配体，以枯草芽孢杆菌芽孢为靶向配体和特异抗原蛋白的传递载体，利用新一代芽孢表面展示技术构建表面展示靶向配体和特异抗原的重组芽孢，制备靶向口服疫苗。以颗粒饲料包被靶向口服疫苗，通过传递载体表面的靶向配体FimH_Ed介导肠道粘膜上皮细胞提取特异抗原。本发明优点在于利用FimH_Ed的靶向作用促进芽孢载体传递的特异抗原突破肠道粘膜上皮屏障，提高了鱼类口服疫苗的免疫保护效果。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及利用爱德华氏菌(Edwardsiella)的I型纤毛蛋白FimH(FimH_Ed)作为特异抗原的靶向配体，以枯草芽孢杆菌芽孢作为靶向配体和特异抗原在鱼类消化道中的运送载体，通过新一代芽孢表面展示技术制备鱼类的靶向口服疫苗。

背景技术

口服疫苗是通过口服途径将特异抗原传递到肠道粘膜免疫器官，诱导包括细胞免疫和体液免疫的粘膜免疫反应[1,2]。口服疫苗操作方便，适合鱼类规模化接种。但鱼类消化道中蛋白酶、粘膜表面粘液、以及致密的粘膜上皮，构成消化道生理屏障[3]，使口服疫苗不能顺利到达粘膜免疫诱导位点和突破粘膜上皮进入粘膜免疫器官，导致口服疫苗免疫保护效果不佳。因此，口服疫苗不仅需要特异的抗原，还需要能将抗原运送到粘膜免疫诱导位点、并能介导特异抗原突破粘膜上皮进入粘膜免疫器官的传递载体。

哺乳动物小肠中的派尔斑和淋巴结是重要的肠道粘膜免疫器官，是抗原诱导肠道粘膜免疫的重要位点[4]。抗原主要通过粘膜免疫器官相关上皮层中的上皮细胞或M细胞表面受体，介导肠腔内抗原的提取，通过不同的转运机制，突破粘膜上皮进入粘膜免疫器官内[5]。尽管鱼类消化道没有派尔斑和淋巴结，但消化道的第二段中有分化程度较低的分散肠道相关淋巴组织[6,7]。这些粘膜免疫器官上皮层细胞也能以类似哺乳动物的机制，提取肠腔内的抗原或病原体，启动粘膜免疫反应。减毒的肠道病原体细菌或病毒[8]、以及一些具有低免疫原性、高生物相溶性脂质体、聚合物等可作为口服疫苗传递载体[9,10]。但这些载体在安全性、自身稳定性、抗原荷载和粘膜吸附能力等方面存在不同程度的缺陷，难以规模化应用[11-13]。

安全且具有独特抗逆性的枯草芽孢杆菌芽胞，被认为是一种潜在的口服疫苗传递载体。利用传统的芽孢表面展示技术将特异抗原展示于芽孢表面，特异抗原可通过动物胃肠道，并能诱导特异性免疫反应[14-17]。但由于传统芽孢表面展示技术以非必须基因作为整合位点，制备的重组芽孢能在小肠前端萌发成营养细胞[18]，导致展示在芽孢表面的异源抗原丢失[19]，影响免疫保护效果。新一代的芽孢表面展示技术，以控制芽孢萌发的关键基因作为重组基因在染色体上的整合位点，制备的表面展示外源抗原蛋白的芽孢萌发抑制，可提高芽孢载体在肠道中的稳定性[22]。但由于芽孢难以突破粘膜上皮屏障，基于芽孢载体的口服疫苗仍难产生理想的免疫效果。

广泛存在于水体环境中一些种类的爱德华氏菌(Edwardsiella)具有I型纤毛[23]，是一种广谱的鱼类病原体，导致鱼类严重的感染性疾病[24,25]。I型纤毛是爱德华氏菌重要的致病因子之一，通过其顶端的蛋白亚基FimH_Ed中的N末端保守结构域与粘膜上皮层细胞表面受体结合，吸附于粘膜表面，并介导爱德华氏菌细菌突破上皮屏障进入体内[23]。因此，FimH_Ed是鱼类口服疫苗传送载体潜在的靶向配体。

本发明的目的是利用FimH_Ed与鱼类肠道粘膜上皮中的细胞表面受体特异结合的特征，以FimH_Ed作为靶向配体，以枯草芽孢杆菌芽孢作为靶向配体和特异抗原在鱼类消化道中的运送载体，通过新一代芽孢表面展示技术制备表面展示特异抗原和靶向配体的重组芽孢，作为鱼类的靶向口服疫苗。

参考文献