[发明专利]鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法，检测方法包括：从待测样品鱼的肾组织中提取RNA，以RNA为模板合成cDNA;以合成的cDNA为模板，采用合成的引物组，进行双重PCR扩增；将双重PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察结果。本发明针对乌鳢水泡病毒保守基因序列，设计相关特异性引物，以及相适宜的PCR反应条件，建立一种乌鳢水泡病毒双重PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高等特点，能够快速、准确地检测出乌鳢水泡病毒，为乌鳢水泡病毒的临床诊断与预防提供了一项重要的技术手段，对实施乌鳢水泡病毒的鉴定、分离、流行病学调查等研究提供了技术方案。

技术领域

本发明涉及一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

PCR即聚合酶链式反应技术，一种类似于参照细胞内的DNA复制过程。该技术是以DNA为模板，加入PCR酶以及对应的特异性引物在PCR仪器中进行程序反应，复制扩增产生新的互补DNA片段。其过程由变性-退火-延伸三个步骤组成，经过多次循环，2-3小时内就可将DNA扩增放大上百万倍。因其扩增效率高、特异性强、灵敏性高等优点，在分子生物学研究领域得到了广泛的应用。

双重PCR则是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案，与一般PCR技术有所区别的是，双重PCR需要一次性加入两对引物，在同一个反应系统中同时扩增，得到特异性更强的目的条带，与一般PCR相比，具有高效、快捷、经济、简便等优点。

乌鳢水泡病毒(Snakehead fish vesicularvirus,SHVV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，Perhabdovirus属。2014年从养殖池塘的患病杂交鳢体内分离出来，该病毒能够感染鳢科鱼类、鳜鱼、黄鳝等。近年来，该病毒对一些养殖区域造成了极大危害，在一些人工养殖的池塘内，感染初期病鱼体表无明显症状，摄食减弱，体质下降；严重时停止摄食、体色变黑、眼球突出、浮于池边、时而翻滚，不久便死亡。目前尚无有效治疗方法，对于该病毒的鉴定目前也没有专门的文献和技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组、试剂盒及检测方法，能够快速、准确的检测鱼类弹状病毒，为该病毒的临床诊断与预防提供了一项重要的技术手段，对该病毒的鉴定、分离、流行病学调查等研究提供一项技术方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种鱼类弹状病毒双重PCR检测的引物组，所述引物组包括引物SHVV-1和引物SHVV-2，所述引物SHVV-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示，所述引物SHVV-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了鱼类弹状病毒双重PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物组。

本发明还提供了鱼类弹状病毒双重PCR检测方法，包括：

从待测样品鱼的肾组织中提取RNA，以RNA为模板合成cDNA；

以合成的cDNA为模板，采用权利要求1所述的引物组，进行双重PCR扩增；

将双重PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察结果。

优选地，所述RNA提取采用Trizol法。

优选地，所述双重PCR扩增的反应体系为：cDNA模板×1μL、引物SHVV-1F×1μL、引物SHVV-1R×1μL、引物SHVV-2F×1μL、引物SHVV-2R×1μL、Premix Taq×10μL、ddH₂O×5μL，总量20μL。

优选地，所述双重PCR扩增的反应程序为：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，30循环；72℃，5min延伸，4℃保存。