[发明专利]一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用

权利要求书

1.一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌异源表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嗜热菌蛋白酶Npr突变体。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的嗜热菌蛋白酶Npr突变体的氨基酸序列是将SEQ ID NO.1所示的亲本序列中，成熟序列的第115位色氨酸突变为甘氨酸，所述成熟序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是以pET系列载体表达嗜热菌蛋白酶Npr。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109或大肠杆菌W3110。

5.一种权利要求1~4任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将嗜热菌蛋白酶编码基因序列与载体连接，构建表达载体；

（2）将步骤（1）构建得到的表达载体转入大肠杆菌宿主中，得到表达嗜热菌蛋白酶的重组大肠杆菌。

6.一种权利要求1~4任一项所述的重组大肠杆菌在全细胞转化合成阿斯巴甜中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是以重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，催化苯丙氨酸甲酯和苄氧羰基天冬氨酸反应生成苄氧羰基阿斯巴甜。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的全细胞催化剂是将重组大肠杆菌在发酵培养基中培养收集得到的菌体，采用缓冲液配制成的细胞悬液；其中，所述的培养是在400~600rpm，25~30℃，通气量为0.8~1.2vvm条件下，培养至菌体OD₆₀₀为0.5~0.7时，添加0.3~0.5 mM的IPTG诱导目的基因表达。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基为酵母粉20~25 g·L^-1，胰蛋白胨10~15 g·L^-1，甘油3~7 mL，15~20 mM磷酸氢二钾和70~75 mM磷酸二氢钾混合溶液80~120 mL。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的催化的体系为300~350mM苯丙氨酸甲酯，70~90 mM苄氧羰基天冬氨酸和20~30 g·L^-1全细胞催化剂，催化的条件为31~37℃，200~250 rpm，反应时间为20~30 h。