[发明专利]一种DP71L基因缺失的重组非洲猪瘟病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明属于预防兽医领域，具体涉及一种DP71L基因缺失的重组非洲猪瘟病毒及其制备方法和应用。本发明发现了非洲猪瘟病毒DP71L蛋白能够抑制cGAS+MITA或MITA诱导的IFNβ的活性，本发明还提供一种DP71L基因缺失的重组非洲猪瘟病毒，该重组非洲猪瘟病毒是将非洲猪瘟病毒的DP71L基因缺失后得到的。将本发明构建的基因缺失非洲猪瘟病毒感染细胞，与野生毒株比较显示，毒力减弱；将本发明构建的基因缺失非洲猪瘟病毒免疫猪后，无死亡等临床症状，血液病毒含量在感染后期显著降低，存活率均为100％，表明该重组病毒充分致弱，作为疫苗是非常安全的。因此可以将上述DP71L基因缺失的重组非洲猪瘟病毒在制备非洲猪瘟疫苗中进行应用，具有相应的社会价值。

技术领域

本发明涉及预防兽医领域，具体为非洲猪瘟病毒潜在疫苗研发和防治，细节涉及到一种天然免疫抑制基因DP71L敲除的重组非洲猪瘟病毒及其构建方法和应用。

背景技术

ASFV(African swine fever Virus)是非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属的唯一成员，主要感染家猪、野猪、疣猪以及钝缘软蜱(Tulman eT al.,2009)，是一种急性、烈性、高度接触性传染病，病毒感染动物死亡率可达到100％。目前尚未研发出有效疫苗和药物预防或治疗。该病毒可以通过各种途径进行传播，如接触、粪便，蜱虫叮咬等，主要在非洲、欧洲、北美洲、加勒比海区域和俄罗斯等多个国家流行，于2018传入中国，在我国所有省、自治区、直辖市均有报道。目前采取的是扑杀进行疫情预防，我国扑杀猪只超过120万头，导致猪存栏数锐减、肉价飞涨，对我国养猪业、经济稳定发展和猪肉供应带来严峻挑战。所以该病成为威胁我国乃至全球养猪业的头号疫病(Gogin eT al.,2013；Zhou eT al.,2018)。依据我国基本国情以及现有防控手段，该病毒疫苗研发是最有效和经济的方法，这也决定研制潜在有效，安全的疫苗十分迫切。

ASFV基因组编码大约170～190左右个基因，其中大部分蛋白功能尚待阐明。病毒的强弱由其毒力基因决定，目前病毒毒力基因功能大致包含如(1)宿主嗜性相关；(2)炎症和免疫反应相关；(3)细胞凋亡相关；(4)细胞信号传导干扰和(6)调节细胞基因表达等。非洲猪瘟病毒主要感染巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞，能够快速突破天然免疫系统、逃逸获得性免疫系统(Canals,Alonso et al.1992,Correia,Ventura et al.2013,Galindo andAlonso2017)，其背后机制仍不清楚，通过阐明“逃逸宿主天然与获得免疫机制”的关键科学问题，利用理论创新驱动安全有效的疫苗实现突破，为国家非洲猪瘟的防控提供理论依据和技术支撑。

ASFV主要的靶细胞是单核/巨噬细胞，巨噬细胞和单核细胞是天然免疫系统的重要组分，在抗病毒感染过程中发挥关键作用。目前已报道多个病毒蛋白具有免疫抑制功能，如CD2v、I329L、DP71L、MGF360和MGF530等。

1)CD2v可助病毒黏附在红细胞表面，被感染细胞可在其周围形成玫瑰样的红细胞花环，从而避免与T细胞及NK细胞的直接接触。2)A238L能够抑制NF-κB转录因子的活化，还能调控NF-κB调控通路下游一氧化氮合酶、粘附分子和补体因子等蛋白的表达与活化，上调MHC-I和MHC-II类分子的表达。3)I329L与TRIF竞争性地结合TLR3，从而拮抗TLR3介导的NF-κB和IRF3活化。4)DP96R，能够部分抑制cGAS-STING信号通路。5)MGF360和MGF530基因家族蛋白抑制I型干扰素表达，同时对I型和II型干扰素诱导的JAK-STAT途径具有抑制作用。6)蛋白DP71L在目前所有的分离株中均存在，能通过和磷酸酶1催化亚基的催化位点作用，抑制eIF2的磷酸化，进而影响细胞的蛋白翻译。蛋白DP71L还能通过抑制细胞凋亡的形式促进病毒复制。结合上述进展，表明非洲猪瘟病毒抑制免疫的机制研究还有很多空白。目前病毒疫苗研究，采用弱毒苗、灭活苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等策略。且由于ASFV基因组较大，确定诱导保护性免疫应答的病毒抗原难度较大。

发明内容