[发明专利]靶向CD19的人源化嵌合抗原受体制备及其应用

权利要求书

1.制备靶向CD19的人源化嵌合抗原受体T细胞的方法，包括如下步骤：

(1)CD19-HuCAR慢病毒载体的构建

在靶向CD19的人源化嵌合抗原受体基因序列的两端添加酶切位点，与慢病毒载体表达质粒pLenti6/V5-p53_R273H质粒双酶切，回收DNA片段、连接、转化、挑取单克隆、抽提质粒，经过酶切和测序鉴定，得到CD19人源化CAR-T质粒pLv6-EF1α-HuCD19；

(2)慢病毒的制备

采用三质粒包装系统，选择慢病毒骨架质粒pMD2.G、pΔR8.91和慢病毒表达质粒pLv6-EF1α-HuCD19，Nanodrop测定提取质粒的浓度，配置转染体系，转染Lenti-293T(例如，其购自TAKARA)细胞，分离提取获得慢病毒原悬液，通过浓缩步骤获得慢病毒浓缩液；

(3)T细胞的分离和培养

选取健康成人外周血，通过淋巴细胞分离液及密度梯度离心获得单个核有核细胞悬液，磁珠激活T细胞，添加活化刺激因子刺激24～48h；

(4)T细胞的感染和扩增

将上述获得的T细胞悬液接种于细胞培养瓶中，并添加制备好的慢病毒浓缩液进行慢病毒感染，感染16～24h后，获得靶向CD19的人源化嵌合抗原受体T细胞。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：

靶向CD19的人源化嵌合抗原受体基因两端添加酶切位点BamH1和Sal1，在慢病毒载体质粒pLenti6/V5-p53_R273H上使用BamH1和Sal1限制性内切酶进行双酶切，将目的序列插入到双酶切位点之间；

靶向CD19的人源化嵌合抗原受体T细胞的制备方法中，所述配置转染体系，转染Lenti-293T细胞；

靶向CD19的人源化嵌合抗原受体T细胞的制备方法中，分离得到的慢病毒浓缩液的操作为：取冻存复苏状态良好的Lenti-293T细胞培养至P5代，将表达质粒pLv6-EF1α-HuCD19、pMD2.G及pΔR8.91质粒按4：1：3的比例与PEI(25000MW)转染试剂及无血清MEM培养基配置成转染体系，混合后转染Lenti-293T细胞，24小时后换液，并于48小时及72小时两次收取病毒原液，并通过超速离心或PEG6000沉淀获得浓缩的慢病毒悬液；和/或

靶向CD19的人源化嵌合抗原受体T细胞的制备方法中，T细胞的分离和培养的操作为：取健康成人外周血一份约100ml，离心获得上清血浆，下层血细胞与生理盐水按体积比1：1混合后再与人淋巴细胞分离液按体积比1：1将血细胞悬液轻置于分离液上层，离心后获得单个核有核细胞悬液；将该悬液与CD3/CD28磁珠共孵育后，活化24h。

3.根据权利要求1的方法，其中：

T细胞培养基选用含2.5％血清替代物的淋巴细胞专用无血清培养基并添加1％自体血浆；和/或

T细胞的接种密度维持在0.5～1×10⁶/ml之间，添加的重组人白细胞介素-2量为500IU/ml。