[发明专利]一种双鸟苷酸环化酶改造基因、编码蛋白、工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种双鸟苷酸环化酶改造基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种根据权利要求1所述的双鸟苷酸环化酶改造基因编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌，其特征在于，所述工程菌由重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌中获得，所述重组质粒由SEQ ID NO.1所示的基因克隆到质粒载体上获得。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BSR(DE3)和Shuffle T7中的一种；所述质粒载体为pET28a、pET32a和pET39a中的一种。

5.一种构建表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行人工合成得到双鸟苷酸环化酶改造基因；

S2：采用NcoI和XhoI双酶切双鸟苷酸环化酶改造基因和质粒载体，对酶切产物进行胶回收；

S3：用T4连接酶连接酶切产物，并将连接产物转化到表达宿主大肠杆菌中；

S4：挑取单菌落接种到装有LB液体培养基的试管中，37℃，220rpm下培养8-12h；提取重组质粒；

S5：进行酶切验证，将含有双鸟苷酸环化酶改造基因的重组质粒进行测序验证，选出双鸟苷酸环化酶改造基因正确的菌株，即为表达双鸟苷酸环化酶改造基因工程菌。

6.一种应用权利要求3所述的工程菌产双鸟苷酸环化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将构建的工程菌接入含有卡那霉素的LB平板37℃培养；

S2：挑取单菌落至含有卡那霉素的LB培养基中培养，形成种子液；

S3：将种子液转接至含有卡那霉素的LB培养基中，培养至OD_600nm为0.6，1.7和3.2；

S4：加入IPTG，诱导2，4，6和8h后收集菌体；

S5：将菌体破碎离心取上清液，经纯化后得纯双鸟苷酸环化酶液。

7.根据权利要求6所述的工程菌产双鸟苷酸环化酶的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S1：将构建的工程菌接入含有50mg/L卡那霉素的LB平板37℃培养12-16h；

S2：挑取单菌落至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养8-12h，形成种子液；

S3：将种子液以2％的接种量转接至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养至OD_600nm为0.6，1.7和3.2；

S4：分别加入终浓度为0.05、0.1、0.5和1.0mmol/L的IPTG，在22，26，30和34℃下诱导发酵，诱导2，4，6和8h后收集菌体，用50mM Tris，pH8.0洗涤菌体；

S5：将菌体破碎，离心收集上清液并经过镍柱纯化，得到纯化后的双鸟苷酸环化酶液。

8.一种应用权利要求7所述的双鸟苷酸环化酶生产环鸟苷二磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：配制含有三磷酸鸟苷、双鸟苷酸环化酶、氯化镁和Tris-HCl缓冲液的反应液于反应器皿中；

S2：反应液在35-70℃下反应，用氢氧化钠调节反应液pH至7.0；

S3：反应结束后，煮沸5min终止反应。

9.根据权利要求8所述的双鸟苷酸环化酶生产环鸟苷二磷酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中三磷酸鸟苷的浓度为2-100mmol/L；双鸟苷酸环化酶的浓度为1mIU/mL～50mIU/mL；氯化镁的终浓度为5-20mmol/L；Tris-HCl缓冲液的pH为6.0-8.0。

10.根据权利要求8所述的双鸟苷酸环化酶生产环鸟苷二磷酸的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为将反应器皿置于水浴锅中调控反应温度，使反应液在35-70℃下反应，每隔2h用氢氧化钠调节反应液pH至7.0，反应时间为2h-48h。