[发明专利]一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述融合型Taq DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶突变体和DNA结合蛋白，所述Taq DNA聚合酶突变体为将野生型Taq DNA聚合酶的螺旋‑发夹‑螺旋DNA结合区的一个或多个位点进行取代突变而获得的蛋白质。本发明的融合型Taq DNA聚合酶具有增强的核酸结合能力、扩增速度和对杂质的耐受能力，对逆转录酶的抑制作用具有良好的抗性，对痕量模板具有良好的扩增性能，可以省略核酸提取步骤而直接对生物样本进行检测；由此构建的一步法RT‑qPCR试剂盒检测速度快、灵敏度高、准确性好，在RNA病毒检测领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

目前，RNA病毒的检测方法主要包括免疫检测和核酸检测，其中，核酸检测以RT-qPCR应用最为广泛，具有检测速度快、准确性高的特点。RT-qPCR即反转录实时荧光定量PCR，首先将RNA模板反转录为cDNA，再利用PCR进行定量检测的技术。RT-qPCR包括荧光染料法和荧光探针法：荧光染料法是利用荧光染料与双链DNA的小沟结合、指示扩增产物的增加；Taqman荧光探针是一段特异性寡核苷酸，两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。探针完整时，荧光基团发射的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光，PCR扩增时，聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，荧光基团和淬灭基团分离从而发出荧光。PCR过程中每一分子产物的生成都伴随着一分子荧光信号的产生，通过记录荧光信号实现对PCR过程的实时监测。利用多重荧光还可以实现对不同基因位点的同时鉴定。

RT-qPCR包括一步法和两步法。一步法RT-qPCR无需构建cDNA文库而克隆微量mRNA，cDNA合成与PCR反应在同一反应体系中进行，省略了cDNA与PCR之间的处理过程。两步法RT-qPCR首先利用反转录酶合成cDNA，随后以cDNA为模板进行PCR，即RNA反转录与qPCR扩增分两步进行。与两步法相比，一步法RT-qPCR快速、简便，降低了污染几率、避免了RNA二级结构的形成、减少了PCR反应的错配率。而两步法RT-qPCR的优势在于存在中间产物cDNA，可以保存，qPCR只取逆转录产物的1/10进行反应，可以调整PCR条件，重现性强，在第二步qPCR反应体系中加入特异性引物，灵敏度高，成本低。但是，两步法RT-qPCR包括第一链cDNA合成和随后的qPCR反应，容易造成污染。在临床的实践应用中，为了快速获得检测结果、避免开盖操作导致的污染问题，主要采用一步法RT-qPCR进行，目前已经获得临床许可的新型冠状病毒肺炎检测试剂盒多基于单重或者多重一步法RT-qPCR。

在一步法RT-qPCR中，一个反应体系中的逆转录酶和DNA聚合酶分别行使cDNA合成和PCR扩增的功能。逆转录酶(RTase)是存在于RNA病毒体内的RNA依赖性DNA聚合酶，具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA的第一条链；(2)Rnase水解活性：水解Rnase杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以一条DNA链为模板合成互补的双链DNA。

在选择逆转录酶时，一般选择无RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶，具有RNaseH活性的逆转录酶会与聚合酶竞争结合RNA模板和DNA引物(或cDNA延伸链)，形成杂合链，并降解杂合链中的RNA链；被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量与长度。DNA聚合酶一般选择具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶。

在文献报道和实际应用中，一步法RT-qPCR存在的主要问题为逆转录酶对DNA聚合酶具有较强的抑制作用，降低了灵敏度和扩增效率，尤其当模板量较低时，容易出现线型斜趴、扩增不起线的现象，严重影响了微量模板的检出率与检测限。目前研究人员对造成这一现象的原因及分子机制尚无清晰的了解，主要通过调整两种酶的比例和缓冲体系组成进行缓解，但是不能从根本上解决这一问题。

发明内容